? Copyright by Wydawnictwo Naukowe PWN S.A., Warszawa 2026Wszystkie prawa zastrzeżone.

Przedruk i reprodukcja w jakiejkolwiek postaci całości bądź części książki bez pisemnej zgody wydawcy są zabronione.

Autorzy i Wydawnictwo dołożyli wszelkich starań, aby wybór i dawkowanie leków oraz wybór i metodyka zabiegów terapeutycznych w tym opracowaniu były zgodne z aktualnymi wskazaniami i praktyką kliniczną. Mimo to, ze względu na stan wiedzy, zmiany regulacji prawnych i nieprzerwany napływ nowych wyników badań dotyczących podstawowych i niepożądanych działań leków oraz zabiegów terapeutycznych. Czytelnik musi brać pod uwagę informacje zawarte w ulotce dołączonej do każdego opakowania leku oraz informacje producenta sprzętu lub autorów metod, aby nie przeoczyć ewentualnych zmian we wskazaniach i dawkowaniu leku oraz we wskazaniach i zasadach stosowania zabiegów terapeutycznych. Dotyczy to także specjalnych ostrzeżeń i środków ostrożności. Należy o tym pamiętać, zwłaszcza w przypadku nowych lub rzadko stosowanych substancji oraz nowych lub rzadko stosowanych metod terapeutycznych.

Recenzent: prof. dr hab. n. med. Artur Mamcarz

Wydawca: Agnieszka Szlanta

Redaktor prowadzący: Aneta Lupa-Marcinowska

Redaktor: Elżbieta Kossarzecka

Producent: Anna Bączkowska

Projekt okładki i stron tytułowych: Hubert Grajczak

Ryciny, o ile nie oznaczono inaczej, pochodzą ze zbiorów autorów.

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2026 r. (Wydanie I)

Warszawa 2026

ISBN: 978-83-01-24964-9

DOI: https://doi.org/10.53271/2026.048

Wydawnictwo Naukowe PWN S.A.

ul. G. Daimlera 2, 02-460 Warszawa

tel. 22 695 43 21

www.pwn.pl

Księgarnia wysyłkowa:

tel. 42 680 44 88; infolinia: 801 33 33 88

e-mail: [email protected]

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwo Naukowe PWN S.A.: Michał Latusek

Informacje w sprawie współpracy reklamowej: [email protected]

AUTORZY

dr hab. n. med. Zbigniew Żuber, prof. UAFM

Katedra Pediatrii

Uniwersytet im. A. Frycza-Modrzewskiego w Krakowie

Klinika Pediatrii i Reumatologii

Wojewódzki Specjalistyczny Szpital Dziecięcy im. św. Ludwika w Krakowie

Prezes Polskiego Towarzystwa Reumatologicznego

dr hab. n. med. Agata Sebastian

Katedra i Klinika Reumatologii i Chorób Wewnętrznych

Instytut Chorób Wewnętrznych

Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu

prof. dr hab. n. med. Katarzyna Życińska

Konsultant wojewódzki w dziedzinie medycyny rodzinnej dla województwa mazowieckiego

Klinika Reumatologii, Chorób Tkanki Łącznej i Chorób Rzadkich

Katedra Medycyny Rodzinnej

Warszawski Uniwersytet Medyczny

******

dr n. med. Magdalena Bagrowska

Klinika Reumatologii i Chorób Wewnętrznych

Uniwersytecki Szpital Kliniczny

Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

dr hab. n. med. Bogdan Batko, prof. UAFM

Konsultant krajowy w dziedzinie reumatologii

Klinika Reumatologii i Immunologii

Szpital Specjalistyczny im. J. Dietla

Katedra i Klinika Reumatologii i Immunologii

Uniwersytet im. A. Frycza-Modrzewskiego w Krakowie

lek. Natalia Bień

Klinika Dermatologii, Dermatologii Dziecięcej i Onkologicznej

Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Centralny Szpital Kliniczny

dr n. med. Jarosław Biernat

Klinika Reumatologii i Immunologii

Szpital Specjalistyczny im. J. Dietla

Katedra i Klinika Reumatologii i Immunologii

Uniwersytet im. A. Frycza-Modrzewskiego w Krakowie

lek. Maciej L. Brzosko

Samodzielna Pracownia Diagnostyki Reumatologicznej

Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie

lek. Marek Bubnowski

Miedziowe Centrum Zdrowia S.A. w Lubinie

Oddział Chorób Wewnętrznych i Diabetologii

dr hab. n. med. Anna Felis-Giemza, prof. NIGRiR

Ośrodek Terapii Biologicznej

Narodowy Instytut Geriatrii, Reumatologii i Rehabilitacji im. prof. dr hab. med. Eleonory Reicher w Warszawie

dr n. med. Katarzyna Fischer

Samodzielna Pracownia Diagnostyki Reumatologicznej

Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie

dr hab. n. med. Monika Gos, prof. IMiD

Zakład Genetyki Medycznej

Instytut Matki i Dziecka w Warszawie

dr n. med. Marek W. Karwacki

Katedra i Klinika Onkologii, Hematologii Dziecięcej, Transplantologii Klinicznej, Pediatrii i Chorób Rzadkich

Warszawski Uniwersytet Medyczny

Centrum Koordynowanej Opieki Medycznej nad Pacjentami z Neurofibromatozami i pochodnymi im Rasopatiami, UCK DSK WUM

lek. Wojciech Kmiecik

Katedra Pediatrii

Uniwersytet im. A. Frycza-Modrzewskiego w Krakowie

Klinika Pediatrii i Reumatologii

Wojewódzki Specjalistyczny Szpital Dziecięcy im. św. Ludwika w Krakowie

dr hab. n. med. Monika Komar, prof. UJ

Klinika Chorób Serca i Naczyń

Instytut Kardiologii

Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie

prof. dr hab. n. med. Ilona A. Kopyta

Katedra Chorób Wieku Rozwojowego, filia Bielsko-Biała

Katedra i Klinika Neurologii Dziecięcej

Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

prof. dr hab. n. med. Otylia Kowal-Bielecka

Konsultant wojewódzki w dziedzinie reumatologii dla województwa podlaskiego

Klinika Reumatologii i Chorób Wewnętrznych

Uniwersytecki Szpital Kliniczny

Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

dr hab. n. med. Magdalena Krajewska-Włodarczyk, prof. UWM

Konsultant wojewódzki w dziedzinie reumatologii dla województwa warmińsko-mazurskiego

Klinika Reumatologii

Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie

dr n. med. Piotr Krawiec

Klinika Reumatologii i Immunologii

Szpital Specjalistyczny im. J. Dietla

Katedra i Klinika Reumatologii i Immunologii

Uniwersytet im. A. Frycza-Modrzewskiego w Krakowie

lek. Joanna Król

Oddział Nefrologii, Dializoterapii, Transplantologii

i Chorób Wewnętrznych

NSSU w Krakowie

lek. Jagoda Kruszewska

Klinika Reumatologii, Chorób Tkanki Łącznej i Chorób Rzadkich

Państwowy Instytut Medyczny MSWiA w Warszawie

prof. dr hab. n. med. Katarzyna Krzanowska

Katedra i Klinika Nefrologii i Transplantologii

Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie

dr hab. Marcin Krzanowski, prof. UJ

Klinika Reumatologii i Immunologii

Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie

lek. Małgorzata Kurbiel

Katedra Pediatrii

Uniwersytet im. A. Frycza-Modrzewskiego w Krakowie

Klinika Pediatrii i Reumatologii

Wojewódzki Specjalistyczny Szpital Dziecięcy im. św. Ludwika

w Krakowie

prof. dr hab. n. med. Brygida Kwiatkowska

Klinika Wczesnego Zapalenia Stawów

Narodowy Instytut Geriatrii, Reumatologii i Rehabilitacji im. prof. dr hab. med. Eleonory Reicher w Warszawie

prof. dr hab. n. med. Aleksandra Lesiak

Klinika Dermatologii, Dermatologii Dziecięcej i Onkologicznej

Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Centralny Szpital Kliniczny

dr hab. n. med. Patryk Lipiński, prof. CMKP

III Klinika Pediatrii

Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego w Warszawie

SZPZOZ im. Dzieci Warszawy w Dziekanowie Leśnym

dr n. med. Anna Łusakowska

Klinika Neurologii

Uniwersyteckie Centrum Kliniczne

Warszawski Uniwersytet Medyczny

ERN EURO NMD

dr n. med. Beata Maciążek-Chyra

Klinika Reumatologii i Chorób Wewnętrznych

Instytut Chorób Wewnętrznych

Uniwersytecki Szpital Kliniczny im. J. Mikulicza-Radeckiego we Wrocławiu

dr hab. n. med. Joanna Makowska, prof. UM w Łodzi

Klinika Reumatologii

Uniwersytet Medyczny w Łodzi

dr hab. n. med. Maria Maślińska, prof. NIGRiR

Klinika Reumatologii

Narodowy Instytut Geriatrii, Reumatologii i Rehabilitacji im. prof. dr hab. med. Eleonory Reicher w Warszawie

dr hab. n. med. Izabela Michałus, prof. ICZMP

Klinika Endokrynologii i Chorób Metabolicznych

Regionalne Centrum Chorób Rzadkich

Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi

prof. dr hab. n. med. Joanna Narbutt

Klinika Dermatologii, Dermatologii Dziecięcej i Onkologicznej

Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Centralny Szpital Kliniczny

prof. dr hab. n. med. Marzena Olesińska

Konsultant wojewódzki w dziedzinie reumatologii dla województwa mazowieckiego

Klinika Układowych Chorób Tkanki Łącznej

Narodowy Instytut Geriatrii, Reumatologii i Rehabilitacji im. prof. dr hab. med. Eleonory Reicher w Warszawie

dr n. med. Aleksandra Opinc-Rosiak

Klinika Reumatologii

Uniwersytecki Szpital Kliniczny nr 2

Uniwersytet Medyczny w Łodzi

prof. dr hab. n. med. Agnieszka Owczarczyk-Saczonek

Konsultant wojewódzki w dziedzinie dermatologii i wenerologii dla województwa warmińsko-mazurskiego

Katedra i Klinika Dermatologii, Chorób Przenoszonych Drogą Płciową i Immunologii Klinicznej

Wydział Lekarski

Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie

dr n. med. Joanna Ożga

III Oddział Kliniczny Pediatrii, Reumatologii z pododdziałem Alergologii

Wojewódzki Specjalistyczny Szpital Dziecięcy im. św. Ludwika w Krakowie

prof. dr hab. n. med. Piotr Podolec

Klinika Chorób Serca i Naczyń, Instytut Kardiologii

Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie

Centrum Chorób Rzadkich Układu Krążenia

Krakowski Szpital Specjalistyczny im. św. Jana Pawła II

dr hab. n. med. Hanna Przepiera-Będzak

Konsultant wojewódzki w dziedzinie reumatologii dla województwa lubuskiego

Katedra Reumatologii i Chorób Wewnętrznych

Klinika Chorób Wewnętrznych, Reumatologii, Diabetologii, Geriatrii i Immunologii Klinicznej

Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie

lek. Agnieszka Pszczółkowska

Klinika Dermatologii i Dermatologii Onkologicznej

Uniwersytecki Szpital Kliniczny im. Fryderyka Chopina w Rzeszowie

lek. Maria Rajczak

Klinika Dermatologii, Dermatologii Dziecięcej i Onkologicznej

Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Centralny Szpital Kliniczny

prof. dr hab. n. med. Adam Reich

Konsultant wojewódzki w dziedzinie dermatologii i wenerologii dla województwa podkarpackiego

Zakład i Klinika Dermatologii

Wydział Medyczny

Uniwersytet Rzeszowski

lek. Anna Sączek

Oddział Kliniczny Nefrologii, Dializoterapii, Transplantologii i Chorób Wewnętrznych

Szpital Uniwersytecki w Krakowie

lek. Anna Siwonia

Klinika Wrodzonych Wad Metabolizmu i Pediatrii

Instytut Matki i Dziecka w Warszawie

prof. dr hab. n. med. Jerzy Sułko

Poradnia Chirurgii Urazowo-Ortopedycznej

Wojewódzki Specjalistyczny Szpital Dziecięcy im. św. Ludwika w Krakowie

prof. dr hab. n. med. Jolanta Sykut-Cegielska

Konsultant krajowy w dziedzinie pediatrii metabolicznej

Klinika Wrodzonych Wad Metabolizmu i Pediatrii

Instytut Matki i Dziecka w Warszawie

dr n. med. Karolina Śledzińska

Klinika Pediatrii, Hematologii, Onkologii i Immunologii

Uniwersyteckie Centrum Kliniczne w Gdańsku

Gdański Uniwersytet Medyczny

lek. Jagoda Trochimiuk

Klinika Układowych Chorób Tkanki Łącznej

Narodowy Instytut Geriatrii, Reumatologii i Rehabilitacji im. prof. dr hab. med. Eleonory Reicher w Warszawie

prof. dr hab. n. med. Anna Tylki-Szymańska, prof. emeritus

Instytut "Pomnik - Centrum Zdrowia Dziecka" w Warszawie

prof. dr hab. n. med. Jolanta Wierzba

Klinika Pediatrii, Hematologii, Onkologii i Immunologii

Uniwersyteckie Centrum Kliniczne w Gdańsku

Gdański Uniwersytet Medyczny

dr n. med. Sylwia Wiktorzak

Klinika Układowych Chorób Tkanki Łącznej

Narodowy Instytut Geriatrii, Reumatologii i Rehabilitacji im. prof. dr hab. med. Eleonory Reicher w Warszawie

lek. Marta Wysmołek-Sołtysik

Ośrodek Terapii Biologicznej

Narodowy Instytut Geriatrii, Reumatologii i Rehabilitacji im. prof. dr hab. med. Eleonory Reicher w Warszawie

dr n. med. Aleksandra Zoń-Giebel

Oddział Reumatologii i Rehabilitacji

Szpital Specjalistyczny nr 1 w Bytomiu

PRZEDMOWA

Przed Państwem znakomita monografia, która dotyka niezwykle ważnego obszaru naszej aktywności zawodowej.

Kiedy wybieramy ścieżkę naszej życiowej aktywności i rozpoczynamy piękną przygodę z medycyną, zapewne wielu z nas myśli o tym, że będzie jak śledczy, jak detektyw, który na podstawie trudnych do uzyskania dowodów, poszlak, sugestii, opinii ułoży w jeden spójny, przekonujący obraz historię pacjenta, dobierze zręcznie brakujące elementy i podejmie właściwe decyzje, które zmienią losy człowieka powierzającego nam swoje zdrowie. Zderzenie z rzeczywistością jest często inne, nie zawsze wszystko układa się w tę spójną całość, częściej zajmujemy się chorobami występującymi powszechnie, posługujemy się standardowymi procedurami, które oczywiście są także kluczowe dla nas i naszych pacjentów. Ale zdarzają się sytuacje kliniczne, które uruchamiają mechanizmy szczególnej kontroli, czujności, dociekliwości. To obszar związany z chorobami rzadkimi. I właśnie tego dotyczy opracowanie, które mają Państwo przed sobą.

Pacjenci z chorobami rzadkimi przez lata pozostawali na marginesie systemu ochrony zdrowia. Niska częstość występowania poszczególnych jednostek sprawiała, że ich problemy były rozproszone i niedostrzegane - brakowało wiedzy, jasno określonych ścieżek diagnostycznych i dostępu do leczenia. Wielu chorych latami poszukiwało diagnozy, trafiając od specjalisty do specjalisty. Do dziś część z nich doświadcza ograniczonego dostępu do terapii, wsparcia systemowego i zrozumienia społecznego. Na szczęście to się zmienia.

Czytając Choroby rzadkie. Kompendium, warto zacząć od pewnego paradoksu: choć mówimy o chorobach rzadkich, w praktyce klinicznej wcale nie są one rzadkie. Ich liczba jest tak duża, że każdy lekarz - niezależnie od specjalizacji - ma realną szansę spotkać takiego pacjenta. Prawdziwą trudnością nie jest więc ich "egzotyczność", lecz umiejętność wyłowienia jednego chorego z tłumu pacjentów z objawami niespecyficznymi, postawienia trafnego rozpoznania i wdrożenia właściwego leczenia.

Na tym tle publikacja wyróżnia się jako narzędzie wyjątkowo potrzebne. Autorzy podjęli się ambitnego zadania opisania bardzo szerokiego spektrum chorób rzadkich, koncentrując się jednak przede wszystkim na tych jednostkach, w których współczesna medycyna oferuje realne możliwości diagnostyczne i terapeutyczne. Dzięki temu książka nie jest jedynie katalogiem ciekawostek klinicznych, lecz praktycznym przewodnikiem po obszarze, w którym decyzje lekarza mają bezpośredni wpływ na los pacjenta.

Jednym z największych atutów kompendium jest jego przejrzysta i powtarzalna struktura rozdziałów. Każda jednostka chorobowa została przedstawiona według logicznego schematu: od definicji i epidemiologii, przez patogenezę i podłoże genetyczne, aż po objawy kliniczne i wyodrębnione cechy patognomoniczne. Szczególnie cenne są części poświęcone diagnostyce - z jasno przedstawionymi algorytmami i biomarkerami - oraz leczeniu farmakologicznemu, zaprezentowanemu w formie schematów i diagramów. Uzupełnieniem są informacje o programach lekowych NFZ, powikłaniach, rokowaniu oraz zasadach kompleksowej opieki.

Na podkreślenie zasługuje końcowa część każdego rozdziału, zawierająca syntetyczne podsumowanie problemu klinicznego, wskazówki praktyczne, listę ośrodków eksperckich oraz odniesienia do organizacji pacjenckich. To element, który wyraźnie pokazuje, że autorzy myślą nie tylko o rozpoznaniu choroby, ale o całej ścieżce pacjenta - od pierwszych objawów po długoterminową opiekę.

Szczególnie istotny jest kontekst pracy lekarza pierwszego kontaktu. To właśnie lekarz rodzinny, pediatra czy lekarz POZ najczęściej jako pierwszy styka się z pacjentem, u którego choroba rzadka manifestuje się w sposób niecharakterystyczny. Bardzo ważna jest w tym miejscu czujność diagnostyczna, umiejętność łączenia pozornie niepowiązanych objawów oraz podejście holistyczne. Nie tylko specjalistyczne badania, lecz uważna obserwacja i właściwa interpretacja obrazu klinicznego często stanowią punkt zwrotny w diagnostyce.

Redaktorom opracowania powiódł się zamiar zebrania wybitnych ekspertów, którzy dzielą się z Państwem swoją wiedzą i doświadczeniem, zwracając uwagę na pułapki, odnosząc się do najnowocześniejszych metod diagnostycznych, wskazując najwłaściwsze rozwiązania. Redaktorzy i grono autorów to nie tylko wybitni naukowcy, ale także lekarze praktycy, doświadczeni i rozważni, często odważni w podejmowaniu decyzji.

Choroby rzadkie. Kompendium to zatem nie tylko zbiór wiedzy, ale przede wszystkim narzędzie wspierające myślenie kliniczne, porządkujące proces diagnostyczny i zwiększające szansę na wcześniejsze rozpoznanie i skuteczne leczenie osób z chorobami rzadkimi.

Nie wszyscy z Państwa na swej drodze zawodowej spotkają pacjentów z problemami, o których traktuje ta znakomita monografia, ale może tak się zdarzyć i wtedy ten praktyczny przewodnik ułatwi kliniczne śledztwo i doprowadzi do rozwiązania zagadki, a to przecież często istota naszego zawodu.

Jako prezesowi Polskiego Towarzystwa Medycyny Holistycznej takie kompleksowe podejście do pacjenta jest mi szczególnie bliskie. Myślę, że wszyscy powinniśmy stale wzmacniać czujność, aby wśród niespecyficznych i rozproszonych objawów umieć dostrzec pacjenta z chorobą rzadką i nie przeoczyć momentu, w którym możliwe jest trafne rozpoznanie oraz skuteczne leczenie.

Bardzo gorąco zachęcam do studiowania tego świetnego, nowoczesnego opracowania.

prof. dr hab. n. med. Artur Mamcarz

1WSTĘP

Chciałbym bardzo serdecznie zaprosić do lektury tego wyjątkowego przewodnika po chorobach rzadkich, przeznaczonego dla lekarzy wszystkich specjalności, jednak szczególnie dla reumatologów oraz lekarzy pokrewnych dyscyplin. Tutaj drobna uwaga - pokrewne reumatologii dyscypliny medycyny to cała medycyna. Reumatologia jako jedna z nielicznych dziedzin, podobnie jak interna i pediatria, zajmuje się wszystkimi aspektami choroby naszego pacjenta, podłożem genetycznym, patofizjologią, procesami zaburzeń immunologicznych, a także chorobami współistniejącymi, powikłaniami przebiegu choroby i zastosowanych metod terapeutycznych. Dyscyplina, która zajmuje się w sposób holistyczny pacjentem i jego chorobą, nie może pomijać zagadnień związanych z diagnostyką i leczeniem chorób rzadkich. Nazwa "choroby rzadkie" to jedynie określenie statystyczne, choroba rzadka to jednostka chorobowa występująca rzadziej niż 1:2000 urodzeń a choroba ultrarzadka to występowanie rzadziej niż 1:50 000 urodzeń. Zdecydowana większość chorób "reumatycznych" to choroby rzadkie, a część chorób układowych tkanki łącznej i układowych zapaleń naczyń to choroby ultrarzadkie. Rola reumatologa oraz lekarzy innych dyscyplin jest kluczowa w rozpoznaniu choroby rzadkiej, niezwykle ważnym aspektem naszego działania powinna być zasada, że atypowy objaw u naszego chorego to nie dowód na wykluczenie klasycznej choroby, a asumpt do dalszych kroków diagnostycznych, być może to dowód na obecność nietypowej jednostki chorobowej.

Ambicją twórców tego kompendium było przedstawienie kilkudziesięciu jednostek chorobowych, w przebiegu których objawy "reumatyczne" mogą być kluczowe dla podejrzenia choroby lub postawienia rozpoznania. Kolejnym aspektem tego opracowania jest fakt, że przedstawione choroby są coraz skuteczniej diagnozowane i dla większości z tych chorób są dostępne nowoczesne formy skutecznej terapii. Aktualne możliwości diagnostyczne i terapeutyczne współczesnej medycyny stworzyły nadzieję dla ogromnej rzeszy pacjentów chorujących na choroby określane jeszcze niedawno jako choroby "sieroce". Pacjenci z rozpoznaniem choroby sierocej byli skazani na opiekę paliatywną, bez nadziei na lepszy los i nadziei na jakiekolwiek formy skutecznej pomocy.

To kompendium to obraz ogromnego sukcesu współczesnej medycyny, wyraz nadziei i postępu medycyny, a także przywrócenia optymizmu i widoku na lepsze życie naszych pacjentów.

Zbigniew Żuber

2PODSTAWY PATOFIZJOLOGII CHORÓB RZADKICH Anna Tylki-Szymańska

2.1. Wstęp

Rozpatrując podstawy statusu chorób rzadkich, jeszcze 2-3 dekady wcześniej można było się skupić głównie na dziedziczeniu mendlowskim. Takie bowiem dziedziczenie jest nadreprezentowane w grupie chorób rzadkich.

Jednak w miarę poszerzania według kryterium częstości występowania listy chorób zaliczanych do rzadkich przybyło wiele nowych jednostek nozologicznych, dziedziczących się niekoniecznie według prawa Mendla.

Trzeba tu podkreślić, że kryterium otrzymywania miejsca na tej liście była/jest częstość występowania danej choroby w najczęściej badanych populacjach.

Zacznijmy od początku, wielka przygoda z chorobami rzadkimi była dziełem Organizacji Rzadkich Zaburzeń - luźnej koalicji zwolenników, rzeczników i rodzin pacjentów z rzadkimi chorobami w Stanach Zjednoczonych w latach 70. XX w.

Potrzeba zajęcia się problemem chorób rzadko występujących, a zwłaszcza ich leczenia, wymagała powstania nowego ustawodawstwa wspierającego opracowywanie leków dla zapewnienia skutecznego leczenia pacjentów z chorobami tak rzadkimi, że bez radykalnych środków nie byłoby żadnego lub prawie żadnego uzasadnienia komercyjnego dla kosztów terapii [1].

Ustawa o lekach sierocych, Orphan Drug Act 97/414 (ODA), miała na celu ułatwianie rozwoju leków na rzadkie choroby lub schorzenia. Była to próba zrównoważenia interesów firm farmaceutycznych i pacjentów z rzadkimi chorobami przez tworzenie zachęt finansowych dla firm do rozwijania i wprowadzania na rynek nowych leków początkowo nazywanych "sierocymi".

ODA została wprowadzona w Stanach Zjednoczonych w 1983 r. Singapur podążył za tą inicjatywą w 1991 r., Japonia w 1993 r., a Australia w 1998 r. W 2000 r. Komisja Europejska wprowadziła rozporządzenie WE 141/2000.

Inicjatywa ta przyniosła nie tylko spektakularne wyniki komercyjne (zyski), lecz także odkrycia w zakresie badań translacyjnych, wynikające z rozwoju leków i urządzeń, oraz bardzo potrzebne ogólne korzyści wspierające pacjentów w tej dziedzinie.

Głównym celem było zapewnienie rygorystycznych i kompleksowych informacji na temat rzadkich chorób, do których dostęp mają wszystkie zainteresowane strony.

Jednym z pierwszych narzędzi służących do realizacji tego celu był Orphanet (Orphanet, 2022): założony we Francji przez Narodowy Instytut Zdrowia i Badań Medycznych (INSERM) w 1997 r. i wspierany przez dotacje przyznane przez Komisję Europejską, 3 lata później został włączony jako przedsięwzięcie europejskie.

Nomenklatura Orphanet dotycząca rzadkich chorób (ORPHAcode) zapewnia ich widoczność w systemach informacji o zdrowiu i badaniach [2].

2.2. Częstość występowania jako kryterium kwalifikacyjne do grupy chorób rzadkich

Podstawowym kryterium kwalifikowania do kategorii chorób rzadkich, stosowanym przez agencje regulacyjne leków w celu uzyskania zachęt finansowych do opracowywania nowych terapii, jest częstość występowania choroby w danej populacji.

Zgodnie z definicją przyjętą w Unii Europejskiej "choroby rzadkie" są to choroby występujące z częstością 1 na 2000 osób lub rzadziej. Choroby występujące z częstością 1 na 50 000 lub mniejszą są to choroby ultrarzadkie. Większość chorób rzadkich to właśnie choroby ultrarzadkie występujące zazwyczaj z częstością ok. 1 na 100 000 lub rzadziej do 1 na pół miliona urodzeń. Obecnie uważa się, że istnieje ponad 7000 znanych rzadkich chorób [3].

Częstość występowania przyjęta jako definicja choroby rzadkiej różni się znacznie w zależności od regionu czy populacji. Przykładem są różnice w określeniu progu między populacjami, gdzie dominuje panmiktyczny (losowy) model zawierania małżeństw, a populacjami, w których istnieje znaczny stopień pokrewieństwa (małżeństwa kuzynów), zjawisko to spotykamy w częściach subkontynentu indyjskiego, na Bliskim Wschodzie, Półwyspie Arabskim, wschodniej Turcji, a także w Afryce Północnej [4].

Stąd szacowanie częstości występowania chorób rzadkich jest silnie związane z różnymi kontekstami.

2.3. Ustawa o lekach sierocych - osiągnięcia i nowe wyzwania

Efektem stosowania ustawy o lekach sierocych był przyspieszony rozwój metod terapii przez firmy farmaceutyczne, jednak nie została wygenerowana niezbędna infrastruktura w ramach praktyki klinicznej i badań naukowych - jest to konieczne do racjonalnego koordynowania badań i wprowadzania polityk, które wspierają odkrycia nauk populacyjnych.

Niemniej ciągle brak jest pełnej wiedzy na temat liczby rzadkich chorób i liczby osób nimi dotkniętych. Cechy fenotypowe, genetyczne i środowiskowe, które definiują daną chorobę, są często ustalane różnie w różnych grupach demograficznych, regionach lub kontekstach.

Istnieje w dalszym ciągu wyraźny brak spójności w metodologii i niejednolite definicje częstości występowania rzadkich chorób.

Niedoskonałości w obecnych definicjach rzadkich chorób wpływają na ocenę zasobów pacjentów, podejście do diagnozy i leczenia oraz badania nad mechanizmami rzadkich chorób i potencjalnymi terapiami.

Aby zachęcać do kontaktów i wymiany danych między badaczami i grupami wsparcia pacjentów, zainwestowano znaczne środki we wsparcie pod egidą Narodowych Instytutów Zdrowia i krajowych sieci badań klinicznych nad rzadkimi chorobami. Obejmują one ośrodki badań klinicznych nad rzadkimi chorobami oraz centra koordynacji danych i technologii - wszystko zaprojektowane w celu zwiększenia współpracy i wymiany danych między badaczami i grupami wsparcia pacjentów.

Europejskie Sieci Referencyjne stanowią imponującą inicjatywę, dzięki której można usystematyzować praktykę kliniczną i poprawić dostęp do opinii ekspertów.

Światowa Organizacja Zdrowia przyjęła tę koncepcję za pośrednictwem Międzynarodowej Klasyfikacji Chorób (ICD). Najnowsza wersja zatwierdzona przez Światowe Zgromadzenie Zdrowia weszła w życie 1 stycznia 2022 r.

Statystyki dotyczące zdrowia zgłaszane w ICD-11 rejestrują stany zdrowia i związane ze zdrowiem; zapewniają one wzajemną zgodność cyfrowych danych dotyczących zdrowia i ich porównywalność.

2.4. Patomechanizm chorób rzadkich

Wracając do problemu patofizjologii chorób rzadkich (jak wcześniej wspomniano, w przeważającej liczbie genetycznie uwarunkowanych), należy podkreślić, że konsekwencje defektu genetycznego, jakikolwiek by on nie był, rozpoczynają się już od najwcześniejszych chwil życia, od poczęcia czy też później - w okresie różnicowania tkanek.

Archibald Garrod był pierwszym, który zasugerował, że geny są powiązane z enzymami. Beadle i Tatum potwierdzili hipotezę Garroda. Nazwana została ona "jeden gen - jeden enzym". Jednak w miarę postępu rozumienia mechanizmów biologicznych hipoteza ta musiała zostać zrewidowana, albowiem niektóre geny kodują podjednostki białka, a nie całe białko. Gen ogólnie koduje jeden polipeptyd, a niektóre białka składają się z kilku polipeptydów z różnych genów. Niektóre geny w rzeczywistości kodują funkcjonalne cząsteczki RNA, a nie polipeptydy.

Defekt białka, czy to enzymatycznego, transportowego, sygnalizacyjnego, czy jakiegokolwiek innego, prowadzi do dekompensacji przebiegu szlaku przemiany biochemicznej czy też funkcjonowania komórki. Tak długo, jak mechanizmy kompensacyjne zapewniają homeostazę, nie ma skutków defektu, pojawiają się one w momencie ich wyczerpania. Postacie cięższe manifestują się wcześniej, dlatego pacjenci tacy zwykle trafiają pod opiekę pediatrów.

Tak też próbujemy wyjaśniać różne okresy występowania objawów klinicznych w przypadku tej samej choroby, od postaci bardzo wczesnych, niemowlęcych, młodzieńczych, dorosłych itd. Wiążemy to z rodzajem mutacji (wariantem) genowym, dlatego ważna jest interpretacja wyniku molekularnego.

Przechodząc do ekspresji klinicznej patogennych wariantów genowych, mamy też przypadki, gdzie różne mutacje w obrębie tego samego genu mogą powodować zupełnie inny obraz kliniczny, np. mutacje w genie GLB1 mogą prowadzić zarówno do Gm1 gangliozydozy, jak i do zupełnie niepodobnej do niej mukopolisachrydozy typu IV b.

Dziedziczenie informacji genetycznej zawartej w genomie mitochondrialnym (mtDNA) jest przykładem ogromnej różnorodności ekspresji klinicznej - od postaci bezobjawowych do ciężkich zaburzeń wielonarządowych. Matka przekazująca potomstwu mtDNA może być bezobjawową nosicielką wadliwego genu, natomiast choroba może dać objawy u jej dzieci - zależy to od heteroplazmii.

W ostatniej dekadzie wykazano, że różne warianty patogenne w jednym genie mogą mieć różne konsekwencje kliniczne, zostało to wykazane na przykładzie genu PIK3CA, którego patogenne warianty są powiązane z kilkoma rzadkimi chorobami, znanymi i opisywanymi jeszcze w dawnej literaturze medycznej.

Tworzą one grupę PRD (PIK3CARare Diseases). Mechanizmy molekularne leżące u podstaw PRD zostały odkryte w momencie zidentyfikowania wariantów mozaikowego zdobycia funkcji przez gen PIK3CA, kodującego podjednostkę katalityczną kinazy 3-fosfatydyloinozytolu ? (PI3K?). PI3K? jest kinazą lipidową promującą wzrost, proliferację i przeżycie komórek. Wczesne opisy kliniczne dotyczyły pacjentów z wadami rozwojowymi i asymetrycznym segmentowym przerostem. Niedawno opisano wiele rzadkich zespołów, które mają wspólną tendencję do przerostu. Klasyfikowano je według ich cech klinicznych i głównego przedziału tkankowego, np. przerost włóknisto-tłuszczowy, wady naczyń włosowatych, makrodaktylia lub megalencephalia. Jednakże zdarzenia genetyczne leżące u podstaw tych zaburzeń nie zostały wyjaśnione aż do 2012 r., kiedy to warianty PIK3CA zidentyfikowano u pacjentów z zespołem CLOVES (wrodzony tłuszczakowy przerost, malformacje naczyniowe ściśle powiązane z innymi zaburzeniami przerostu, takimi jak zespół Proteusa, zespół Klippela-Trénaunaya, Sturge'a-Webera i hemihipertrofia, aby wymienić kilka. Mutacje te nie są dziedziczne, ale występują we wczesnych etapach rozwoju embrionalnego, gdy trzy warstwy zarodkowe (endoderma, mezoderma i ektoderma) powstają i zaczynają określać swój przyszły rozwój. Dlatego objawy kliniczne będą się ostatecznie różnić w zależności od warstw, które są dotknięte, i etapu embrionalnego, na którym występuje mutacja [5].

W ostatnich latach poczyniono znaczne postępy w diagnostyce genetycznej, rozumieniu patogenezy, mechanizmów molekularnych i wynikających stąd skutków klinicznych.

Inną, dopiero co wyłaniającą się hipotezą, pozostaje niewyjaśnione znaczenie nosicielstwa wariantów genowych dla ryzyka wystąpienia z czasem zupełnie innych chorób, jak w przypadku choroby Gauchera i choroby Parkinsona. GBA1-PD stanowi odrębny i złożony podzbiór choroby Parkinsona, charakteryzujący się unikalnymi cechami klinicznymi, patologicznymi i molekularnymi [6].

2.5. Diagnostyka i terapia w chorobach rzadkich

Diagnostyka molekularna ze wględu na malejące koszty sekwencjonowania genomu jest stosunkowo łatwo dostępną metodą w medycynie precyzyjnej w przypadku chorób rzadkich. Stała się nawet badaniem genetycznym pierwszego wyboru u osób z podejrzeniem choroby rzadkiej. Należy jednak zwrócić uwagę, że metoda "pierwszego wyboru" nie może być metodą wyprzedzającą klasyczną diagnostykę, a więc wywiad, badanie przedmiotowe, analizę wyników badań.

Najnowocześniejsze technologie, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji i analizy transkryptomiki pojedynczej komórki lub przestrzennej, przybliżają nas o krok do zrozumienia mechanizmów choroby, dynamiki czasoprzestrzennej i komunikacji międzykomórkowej - wiele aspektów chorób rzadkich czeka jeszcze na wyjaśnienie.

Opieka medyczna nad pacjentami z chorobami rzadkimi obejmuje o wiele więcej niż tylko ocenę działania efektu konkretnych drogich leków, ale przede wszystkim bezpośrednie szczególne interakcje z pacjentem i łagodzenie objawów specyficznych jego choroby. Pojęcie "leczenia choroby rzadkiej (genetycznej)" nie jest porównywalne z wyleczeniem chorego z choroby o egzogennym czynniku patogennym.

Istnieje jeszcze konieczność dokonywania przeglądu wszystkich leków na rzadką chorobę, aby upewnić się, że skuteczność każdej drogiej terapii jest dokładnie zrozumiana, zbadana i oceniona według tego, czy osiąga klinicznie wyraźne wyniki.

Oceny, które obejmują weryfikację tolerancji i skuteczności terapii przez pacjentów, którzy otrzymują dany środek, zyskują wiarygodność. Koncepcje "warunkowego zatwierdzenia regulacyjnego" i "płatności za wyniki" w zakresie marketingu i refundacji również zyskują na popularności.

Można powiedzieć, że przygoda z chorobami rzadkimi, która rozpoczęła się w połowie XX w., zmieniając aspekty poznawcze, pozostaje in statu nascendi, obiecując w przyszłości wiele nowych zaskoczeń i odkryć.

Piśmiennictwo

3DIAGNOSTYKA GENETYCZNA CHORÓB RZADKICH Monika Gos

Większość chorób rzadkich ma podłoże genetyczne - oznacza to, że za ich wystąpienie odpowiedzialna jest obecność zmian w DNA pacjenta. Kluczowe zatem jest zidentyfikowanie wariantów patogennych (określanych kiedyś jako mutacje) stanowiących przyczynę wystąpienia choroby, co może przełożyć się nie tylko na objęcie rodziny pacjenta poradnictwem genetycznym, lecz także może pozwolić na wdrożenie odpowiedniego postępowania terapeutycznego, w tym leczenia celowanego. Określenie genetycznej przyczyny wystąpienia choroby może także zapobiec powikłaniom, które mogą pojawić się wskutek nieodpowiedniej interwencji medycznej (ryc. 3.1).

Rycina 3.1. Cele prowadzenia diagnostyki genetycznej.

Szacuje się, że ok. 80% chorób rzadkich to tzw. choroby monogenowe - spowodowane obecnością patogennego wariantu/wariantów w konkretnym genie. Niektóre z nich, tak jak na przykład zespół Ehlersa-Dalosa, wykazują heterogenność genetyczną - za wystąpienie określonego fenotypu odpowiedzialne mogą być warianty w różnych genach (np. COL5A1, COL5A2, TNXB, AEBP1 lub inne), co może komplikować diagnostykę choroby. Problem diagnostyczny mogą także stanowić choroby o dziedziczeniu wieloczynnikowym, w których wystąpienie fenotypu jest wypadkową predyspozycji genetycznej (wariantów o niskiej penetracji w kilku genach/loci) i działania czynników środowiskowych. Przykładem takiej predyspozycji są warianty genów HLA - obecność określonych alleli zwiększa ryzyko zachorowania. Badania przeprowadzone na wielu populacjach wykazały, że obecność allela HLA-B*51 zwiększa ryzyko zachorowania na chorobę Behçeta.

Jeszcze do niedawna diagnostyka genetyczna była długotrwała i oparta na testach celowanych - umożliwiające analizę konkretnych zmian w powiązaniu ze zdefiniowanym fenotypem. Bardzo często pacjenci doświadczali tzw. odysei diagnostycznej, a ustalenie ostatecznego rozpoznania klinicznego zajmowało wiele lat. Aktualnie stosowane techniki wysokoprzepustowe umożliwiają zbadanie całego genomu w trakcie jednej procedury diagnostycznej, co znacząco przyspieszyło proces identyfikacji genetycznej przyczyny fenotypu pacjenta. Coraz częściej mamy do czynienia z tzw. odwrotną genetyką (reverse genetics) - ustaleniem jednoznacznego rozpoznania klinicznego na podstawie wyniku badań genetycznych i obecności wariantu patogennego w konkretnym genie.

Techniki wysokoprzepustowe są szczególnie przydatne w sytuacjach, gdy pacjent ma objawy, które mogą pojawić się w przebiegu wielu różnych zespołów chorobowych, lub gdy dany zespół wad wrodzonych może być spowodowany obecnością wariantów w kilku lub kilkunastu różnych genach. Są jednak sytuacje kliniczne, w których znacznie lepiej sprawdzi się diagnostyka celowana i analiza konkretnych wariantów w DNA. Ważna jest zatem dokładna znajomość podłoża molekularnego danej choroby i współpraca z laboratorium, które pomoże w doborze odpowiedniego badania diagnostycznego.

Badania genetyczne, podobnie jak inne czynności diagnostyki laboratoryjnej, odbywają się w medycznym laboratorium diagnostycznym i są nadzorowane przez specjalistów laboratoryjnej genetyki medycznej lub medycznej genetyki molekularnej. Skierowaniu na badania genetyczne powinna towarzyszyć uświadomiona zgoda na ich wykonanie (deklaracja świadomej zgody) podpisana przez pacjenta lub jego przedstawiciela ustawowego. Wynika to z faktu, że informacja, jakiej dostarczają badania genetyczne, jest informacją unikalną, indywidualną dla każdej badanej osoby, traktowaną jako dane wrażliwe. Ponadto może ona mieć wpływ nie tylko na samego pacjenta, lecz także na jego najbliższych krewnych, zatem osoba wyrażająca zgodę na badanie musi mieć świadomość jego konsekwencji.

3.1. Materiał do badań genetycznych

W przypadku diagnostyki postnatalnej materiał do badań genetycznych stanowi zazwyczaj krew obwodowa, pobierana do specjalnych probówek z antykoagulantem (np. EDTA, heparyna). Z próbki krwi izolowany jest kwas nukleinowy (DNA lub RNA) wykorzystywany do badań z zastosowaniem technik genetyki molekularnej lub zakładane są hodowle komórkowe na potrzeby diagnostyki prowadzonej metodami cytogenetyki klasycznej (analiza kariotypu). Krew nie może być stosowana jako materiał do badań genetycznych wtedy, gdy u pacjenta została wykonana transfuzja - należy odczekać przynajmniej 2 miesiące, zwłaszcza wtedy, gdy został podany preparat zawierający leukocyty - lub gdy został u niego wykonany przeszczep szpiku. W drugim przypadku jako materiał do badań genetycznych można wykorzystać fragment skóry pacjenta (fibroblasty) lub cebulki włosowe. Izolacja DNA może zostać wykonana z wymazu z policzka, śliny lub z próbki krwi pobranej na specjalną bibułę. W takich sytuacjach ilość materiału i/lub jego jakość mogą być niewystarczające do przeprowadzenia badań kompleksowych, takich jak sekwencjonowanie eksomowe lub genomowe.

W diagnostyce prenatalnej wykorzystuje się komórki uzyskane z biopsji trofoblastu (kosmówki), amniocentezy (pobrania płynu owodniowego) lub kordocentezy (pobranie krwi pępowinowej). Ponieważ pozyskana ilość materiału może być niewystarczająca do przeprowadzenia badań genetycznych lub z powodu wymagań metodycznych (np. dla potrzeb analizy kariotypu), bardzo często w przypadku badań prenatalnych prowadzone są hodowle komórkowe. Nowoczesna diagnostyka przedurodzeniowa wykorzystuje także wolny, krążący DNA płodu, znajdujące się w krwiobiegu matki. Tego typu badania nazywamy nieinwazyjną diagnostyką prenatalną (non-invasive prenatal testing) i są one przede wszystkim wykorzystywane jako test przesiewowy umożliwiający ocenę ryzyka wystąpienia u płodu liczbowych aberracji chromosomowych lub zmian strukturalnych odpowiedzialnych za zespoły mikrodelecyjne/mikroduplikacyjne. Pojawiają się także próby wykorzystania tego materiału do prenatalnej diagnostyki chorób monogenowych.

3.2. Metody stosowane w badaniach genetycznych

Choroby rzadkie, zwłaszcza te związane z zaburzeniami tkanki łącznej, są najczęściej chorobami monogenowymi, spowodowanymi obecnością wariantu/wariantów patogennych w określonym genie. Z tego powodu ich diagnostyka opiera się głównie na analizie zmian dotyczących konkretnego genu - wariantów pojedynczych nukleotydów (SNV, single nucleotide variants) lub zmian liczby kopii (CNV, copy number variants) - delecji/duplikacji całego genu lub jego fragmentu. W rzadkich przypadkach stwierdza się obecność rozległych rearanżacji chromosomowych (translokacji, inwersji; określane także jako warianty strukturalne - SV, structural variants), które mogą prowadzić do zmian ekspresji konkretnego genu. Do identyfikacji zmian SNV i CNV stosowane są techniki genetyki molekularnej, takie jak: łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR, polymerase chain reaction) i jej modyfikacje, hybrydyzacja z sondami molekularnymi oraz sekwencjonowanie. Translokacje czy inwersje mogą zostać zidentyfikowane metodami cytogenetyki klasycznej (np. analizy kariotypu) lub nowoczesnych technik molekularnych, takich jak sekwencjonowanie następnej generacji lub optyczne mapowanie genomu (OGM, optical genome mapping; ryc. 3.2).

Rycina 3.2. Rodzaje wariantów genetycznych i metody stosowane w ich analizie.

Techniki genetyki molekularnej wykorzystują zdolność kwasów nukleinowych do tworzenia kompleksów pomiędzy sekwencjami komplementarnymi względem siebie. Dzięki temu możliwe jest wykorzystanie specyficznych oligonukleotydów (krótkich polimerów składających się z określonych nukleotydów) do badania zmian w konkretnych genach lub regionach chromosomowych. Oligonukleotydy można wykorzystać jako sondy molekularne, które umożliwiają detekcję specyficznych sekwencji DNA - jest to podstawa działania techniki hybrydyzacji. Sondy oligonukleotydowe są wykorzystywane w porównawczej hybrydyzacji genomowej do mikromacierzy (aCGH, array comparative genomic hybridization), w innych technikach mikromacierzowych (mikromacierze SNP, mikromacierze ekspresyjne) czy fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH, fluorescence in situ hybridization).

Oligonukleotydy mogą być także wykorzystane jako specyficzne startery umożliwiające powielenie określonej sekwencji nukleotydowej - są one podstawowym składnikiem łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), której produkt może zostać poddany dalszej analizie, w tym sekwencjonowaniu. Bardziej zaawansowane metody genetyki molekularnej - sekwencjonowanie panelowe czy zależna od ligacji multipleksowa amplifikacja sond (MLPA, multiplex ligation dependent probe amplification) wykorzystują obie techniki: PCR i hybrydyzację ze specyficznymi sondami.

1. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) i jej modyfikacje

Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) jest techniką opracowaną w latach 80. XX w. przez K. Mullisa. Umożliwia ona wielokrotne powielenie (amplifikację) określonego fragmentu/fragmentów DNA i cechuje się wysoką czułością i specyficznością. Mimo rozwoju innych metod diagnostycznych technika ta w dalszym ciągu jest powszechnie wykorzystywana w genetycznych laboratoriach diagnostycznych. Stosuje się ją przede wszystkim w diagnostyce celowanej, skupiającej się na identyfikacji znanych wariantów powiązanych z określoną chorobą. Klasyczna technika PCR jest techniką jakościową i wymaga podjęcia dodatkowych czynności, takich jak elektroforeza żelowa lub kapilarna, w celu uzyskania informacji o wyniku badania. Ze względu na czasochłonność tych procesów rozwój techniki PCR oparty był na wykorzystaniu barwników fluorescencyjnych i automatyzacji procesu detekcji produktu reakcji amplifikacji. Przykładowe techniki PCR, które wykorzystuje się aktualnie w diagnostyce genetycznej, to:

Produkt PCR jest także wykorzystywany jako matryca do reakcji sekwencjonowania - odczytu sekwencji nukleotydowej określonego fragmentu DNA.

2. Technika sekwencjonowania metodą Sangera

Technika sekwencjonowania metodą Sangera po raz pierwszy została wykorzystana w latach 70. ubiegłego wieku i stosowana jest w wersji zmodyfikowanej do dzisiaj. Określana jest także mianem sekwencjonowania pierwszej generacji i umożliwia analizę sekwencji nukleotydowej pojedynczego fragmentu DNA. Była wykorzystywana w trakcie projektu sekwencjonowania genomu ludzkiego przez konsorcjum International Human Genome Mapping oraz firmę Celera Genomics.

Reakcja sekwencjonowania prowadzona tą metodą przypomina technikę PCR, z tą różnicą, że wykorzystywany jest pojedynczy starter, od którego zaczyna się synteza nici potomnej. Składnikiem reakcji sekwencjonowania są także, poza zwykłymi nukleotydami, dideoksynukleotydy znakowane specyficznymi barwnikami fluorescencyjnymi. Wbudowanie dideoksynukleotydów w syntetyzowaną nić blokuje przyłączanie kolejnych nukleotydów. Produktem reakcji sekwencjonowania jest mieszanina fragmentów o różnej długości, zakończonych określonym dideoksynukleotydem znakowanym specyficznym barwnikiem. Rozdział tych fragmentów w sekwenatorze kapilarnym umożliwia odczyt sekwencji nukleotydowej analizowanego fragmentu.

Technika sekwencjonowania metodą Sangera jest powszechnie stosowana do analizy wariantów pojedynczych nukleotydów, zwłaszcza w badaniach rodzinnych (analiza dziedziczenia). Jest także przydatna w analizie małych genów (do 10 analizowanych fragmentów). Jest także techniką z wyboru, jeśli analizowane są geny wykazujące wysoką homologię względem innych regionów w genomie (np. względem swoich pseudogenów, przykładowe geny CYP21A2, TNXB, GBA1 powiązane odpowiednio z wrodzonym przerostem nadnerczy, zespołem Ehlersa-Danlosa typu podobnego do klasycznego oraz chorobą Gauchera). Plusem tej techniki jest jej uniwersalność, ponieważ dysponując produktem amplifikacji określonego fragmentu DNA, możemy przeanalizować jego sekwencję bez konieczności zakupu dedykowanych sond, jak w przypadku ilościowego PCR.

3. Sekwencjonowanie następnej generacji

Mimo swojej uniwersalności technika sekwencjonowania metodą Sangera jest dość czasochłonna. Wspominany projekt sekwencjonowania genomu ludzkiego zajął 13 lat, stąd dość szybko zaczęto poszukiwać technik, które umożliwiłyby szybszy odczyt sekwencji nukleotydowej. Efektem była metoda określana mianem wysokoprzepustowego sekwencjonowania równoległego (high-throughput parallel sequencing), która lepiej jest znana jako sekwencjonowanie następnej generacji (NGS, next-generation sequencing). Jest to metoda, która umożliwia jednoczasową analizę sekwencji wielu fragmentów DNA, a dzięki swojej zwiększonej przepustowości umożliwia skrócenie czasu analizy przy jednoczesnym obniżeniu jej kosztów (ryc. 3.3).

Rycina 3.3. Porównanie zakresu badań z wykorzystaniem sekwencjonowania następnej generacji (NGS).

tNGS - sekwencjonowanie celowane (panelowe), WES - sekwencjonowanie eksomu, WGS-SR - sekwencjonowanie genomu z wykorzystaniem krótkich odczytów, WGS-LR - sekwencjonowanie genomu z wykorzystaniem długich odczytów.

W zależności od zakresu badania możemy wyróżnić:

Ze względu na dużą ilość generowanych danych analiza danych z sekwencjonowania następnej generacji wymaga specjalnego podejścia i wykorzystania dedykowanych narzędzi bioinformatycznych do analizy danych surowych z sekwenatora oraz do adnotacji wariantów. Wynikiem badania i analizy bioinformatycznej jest lista wariantów, które są unikalne dla badanej osoby w odniesieniu do genomu referencyjnego, opublikowanego w bazach danych. Szacuje się, że z sekwencjonowania genomu można uzyskać informację o 5 mln wariantów pojedynczych nukleotydów, spośród których jeden lub dwa są wariantami sprawczymi, odpowiedzialnymi za wystąpienie choroby genetycznie uwarunkowanej. Tak duża liczba wariantów sprawia, że konieczne jest zautomatyzowanie analizy poprzez stosowanie odpowiedniej filtracji wariantów w oparciu o kryteria jakościowe, częstość występowania w populacjach kontrolnych, wpływ wariantu na produkt danego genu i powiązanie genu z fenotypem pacjenta.

Sekwencjonowanie następnej generacji początkowo było oparte na tzw. krótkich odczytach. Technologie stosowane w diagnostyce genetycznej umożliwiają odczyt sekwencji nukleotydowej o długości do kilkuset par zasad, co umożliwia wiarygodną identyfikację wariantów SNV w większości regionów chromosomowych. Problematyczne regiony to sekwencje o wysokiej homologii sekwencji nukleotydowych lub sekwencje powtórzone. W tych regionach analiza wariantów może nie dać wiarygodnych wyników, co stanowi znaczące ograniczenie tej technologii. Technika nie umożliwia także identyfikacji zmian liczby kopii, a ewentualna analiza pod kątem CNV ma jedynie charakter predykcyjny i wymaga weryfikacji z zastosowaniem innych technik. Jeśli wynik analizy predykcyjnej nie wskazuje na obecność CNV, a wcześniej nie wykonywano badań w tym kierunku, należy rozważyć ich wykonanie z zastosowaniem dedykowanych technik.

Jednym z kierunków rozwoju NGS jest sekwencjonowanie z wykorzystaniem długich odczytów, często opisywane jako sekwencjonowanie trzeciej generacji. Technika ta umożliwia analizę dłuższych sekwencji nukleotydowych (nawet do kilkudziesięciu tysięcy par zasad), co pozwala na identyfikację nie tylko zmian SNV, lecz także CNV i wariantów strukturalnych. Umożliwia także haplotypowanie - stwierdzenie, czy zidentyfikowane warianty znajdują się na jednym czy na dwóch chromosomach. Ma to szczególne znaczenie w chorobach dziedziczących się w sposób autosomalny recesywny, gdy nie ma możliwości zbadania rodziców. Technika sekwencjonowania genomu z wykorzystaniem długich odczytów nie jest techniką wykorzystywaną w rutynowej diagnostyce genetycznej, ma ona na razie charakter naukowy ze względu na wysokie koszty analizy i konieczność posiadania dużych zasobów informatycznych do analizy danych.

Warto wspomnieć także o możliwości wykorzystania sekwencjonowania następnej generacji do analizy RNA, tzw. analizie transkryptomu. Badania te, podobnie jak sekwencjonowanie z wykorzystaniem długich odczytów, mają charakter bardziej naukowy niż diagnostyczny. Niemniej jednak analiza transkryptomu może umożliwić identyfikację zmian ekspresji genów lub zmian w sekwencji transkryptu powstającego z danego genu. W drugim przypadku taka zmiana może wskazywać na obecność wariantu intronowego, którego obecność zaburza proces składania eksonów danego transkryptu (tzw. splicingu). Taką analizę warto zatem rozważyć w sytuacji, gdy podejrzewamy u pacjenta określoną chorobę dziedziczącą się w sposób autosomalny recesywny, a analiza sekwencji danego genu wskazała obecność tylko jednego patogennego wariantu z nią powiązanego.

4. Zależna od ligacji multipleksowa amplifikacja sond (MLPA)

Technika MLPA jest metodą stosowaną do identyfikacji zmian liczby kopii określonych regionów chromosomowych. Metoda wykorzystuje sondy oligonukleotydowe komplementarne względem analizowanych regionów, które po hybrydyzacji są łączone ze sobą za pomocą enzymu - ligazy. Kolejnym etapem jest amplifikacja sond po ligacji i elektroforeza kapilarna. Dane uzyskane dla pacjentów porównywane są do próbek kontrolnych o prawidłowej liczbie kopii badanego regionu i na tej podstawie identyfikowane są delecje lub duplikacje. Technika MLPA będzie pierwszą techniką diagnostyczną w przypadku podejrzenia dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD) lub rdzeniowego zaniku mięśni (SMA).

Metoda MLPA i dedykowane zestawy sond umożliwiają identyfikację delecji/duplikacji nawet pojedynczych eksonów. Metoda ma wysoką czułość - sondy nie zwiążą się z analizowaną sekwencją, gdy występuje różnica nawet pojedynczego nukleotydu. Dlatego też w niektórych zestawach znajdują się także sondy do identyfikacji wariantów punktowych, najczęściej identyfikowanych w danym genie (np. p.Phe508del w CFTR powiązany z patogenezą mukowiscydozy).

Odmianą techniki jest metylospecyficzna MLPA (MS-MLPA) - technika półilościowa umożliwiająca analizę metylacji w określonych regionach genomu. Technika wykorzystuje metylowrażliwy enzym restrykcyjny HhaI, który przecina DNA wtedy, gdy jest niemetylowany. Porównanie wyników dla próbki traktowanej enzymem i poddanej wyłącznie ligacji umożliwia ocenę poziomu metylacji w analizowanym regionie chromosomowym. Technika MS-MLPA jest wykorzystywana w diagnostyce chorób związanych z zaburzeniami rodzicielskiego piętna genomowego (np. zespołem Pradera-Williego, zespołem Angelmana, zespołem Beckwitha-Wiedemanna, zespołem Silvera-Russella i in.).

5. Mikromacierze

Mikromacierze to narzędzie, które w diagnostyce genetycznej wykorzystywane jest do analizy całego genomu pod kątem obecności delecji/duplikacji (CNV). Badanie wykorzystujące mikromacierze jest określane jako "kariotyp molekularny", gdyż umożliwia identyfikację zmian, które nie zostałyby wykryte w klasycznej analizie kariotypu (minimum detekcji >5 Mpz). Jest to także technika wysokoprzepustowa, gdyż umożliwia analizę tysięcy regionów chromosomowych, w przeciwieństwie do techniki FISH, w której liczba badanych loci jest ograniczona ze względu na możliwość zastosowania ograniczonej liczby barwników fluorescencyjnych.

Najczęściej w laboratoriach diagnostycznych stosowana jest porównawcza hybrydyzacja genomowa do mikromacierzy (aCGH), w której wykorzystuje się analizę różnicy fluorescencji między próbką badaną i kontrolną. Rozdzielczość mikromacierzy, czyli zdolność do wykrywania zmian o określonej wielkości, zależy od liczby sond, które unieruchomione są na specjalnych szkiełkach. Im większa liczba stosowanych sond, tym większa rozdzielczość badania i tym mniejsze delecje/duplikacje mogą być identyfikowane. Ograniczeniem techniki aCGH jest to, że nie umożliwia ona identyfikacji aberracji chromosomowych zrównoważonych i triploidii. Z tego powodu w przypadku podejrzenia obecności aberracji chromosomowej tego typu należy wykonać dodatkowo klasyczną analizę kariotypu. Innym ograniczeniem techniki aCGH jest brak możliwości identyfikacji zmian, które występują w niewielkim odsetku komórek (mozaikowatość somatyczna <10-20%).

Nieco więcej informacji dostarczają mikromacierze SNP wykorzystujące sondy specyficzne względem wielu wariantów pojedynczych nukleotydów (SNP, single nucleotide polymorphism) znajdujących się w genomie człowieka. Ten rodzaj mikromacierzy nie tylko umożliwia identyfikację zmian typu CNV, lecz także umożliwia analizę danych pod kątem obecności disomii jednorodzicielskiej (UPD, uniparental disomy) lub utraty heterozygotyczności (LOH, loss of heterozygosity). Informacja ta może być przydatna w badaniach pacjentów, u których podejrzewamy chorobę związaną z defektem rodzicielskiego piętna genomowego. Obecność regionów homozygotycznych może także świadczyć o możliwości wystąpienia w obu allelach danego genu wariantów patogennych - sprawczych dla fenotypu dziedziczącego się w sposób autosomalny recesywny.

Badanie z wykorzystaniem mikromacierzy jest wskazane jako badanie pierwszego rzutu w przypadku niepełnosprawności intelektualnej, zaburzeń ze spektrum autyzmu, obecności wad wrodzonych lub w diagnostyce prenatalnej, jeśli wyniki badania USG są nieprawidłowe.

Tabela 3.1. Podsumowanie genetycznych metod diagnostycznych uwzględniające typy identyfikowanych wariantów

Metoda

Typ identyfikowanych zmian

Uwagi

Diagnostyka celowana

Sekwencjonowanie metodą Sangera

SNV

Analiza sekwencji pojedynczego fragmentu DNA, czułość diagnostyczna >99%

Modyfikacje techniki PCR do identyfikacji konkretnych wariantów (w tym ilościowy PCR)

Wybrane SNV

Techniki dedykowane do identyfikacji konkretnych wariantów, o wysokiej czułości diagnostycznej

TP-PCR

Ekspansje powtórzeń (mutacje dynamiczne)

Czułość diagnostyczna >99%

MLPA

CNV określonych regionów chromosomowych, wybrane SNV

Czułość diagnostyczna 97-100%; metoda wrażliwa na obecność SNV

MS-MLPA

Analiza metylacji DNA w określonych regionach chromosomowych

Czułość diagnostyczna >99%; metoda umożliwia także identyfikację CNV w badanym regionie

Diagnostyka wysokoprzepustowa/genomowa

Sekwencjonowanie następnej generacji - krótkie odczyty

SNV, predykcyjnie CNV i SV

Czułość diagnostyczna >99%, spada w regionach bogatych w GC, w sekwencjach powtórzonych i o wysokiej homologii do pozostałych miejsc w genomie

Diagnostyka wysokoprzepustowa/genomowa

Sekwencjonowanie następnej generacji - długie odczyty

SNV, CNV, SV

Sekwencjonowanie III generacji, metoda bardziej naukowa niż diagnostyczna ze względu na koszty

Mikromacierze aCGH

CNV

Czułość diagnostyczna 90-98%

Mikromacierze SNP

CNV, LOH, UPD

Czułość diagnostyczna 90-94,4%

Analiza kariotypu

CNV, SV

Identyfikacja zmian o wielkości > 5 Mbp, wariantów strukturalnych (translokacje, inwersje zrównoważone); triploidii

[Skróty: SNV - warianty pojedynczych nukleotydów; CNV - warianty typu zmiany liczby kopii; SV - warianty strukturalne; LOH - utrata heterozygotyczności; UPD - disomia jednorodzicielska].

3.3. Klasyfikacja wariantów

Nie każdy wariant typu CNV lub SNV zidentyfikowany metodami cytogenetycznymi lub molekularnymi ma charakter patogenny i jest znaczący klinicznie. Niektóre warianty mają charakter polimorfizmów - zmian, które występują u wielu osób z danej populacji, ich obecność zaś nie jest związana jednoznacznie z określonym stanem klinicznym. Kluczowa staje się zatem interpretacja obecności wariantów CNV lub SNV pod kątem ich powiązania z objawami klinicznymi osoby badanej. Bardzo często ocena patogenności wariantów wymaga ścisłej współpracy pomiędzy genetykiem klinicznym lub lekarzem specjalistą zlecającym określone badanie oraz pracownikiem laboratorium diagnostycznego, zwłaszcza jeśli nie była dotychczas opisana w bazach danych.

Dla obu typów wariantów (CNV i SNV) stosowana jest pięciostopniowa klasyfikacja patogenności (tab. 3.2)

Tabela 3.2. Klasyfikacja wariantów CNV i SNV zgodnie z wytycznymi American College of Medical Genetics i European Society of Medical Genetics

Klasa wariantu

CNV

SNV

Patogenny

Punktacja ? 0,99; patogenny charakter wariantu nie powinien budzić wątpliwości.

Przykłady: CNV opisany w wielu recenzowanych publikacjach o udokumentowanym wpływie na fenotyp; unikalny CNV, który obejmuje całkowicie znany region wrażliwy na dawkę; CNV obejmujące wiele genów, spośród których przynajmniej jeden jest wrażliwy na dawkę; również warianty o wielkości >5Mpz (z wykluczeniem znanych wariantów morfologicznych)

Mocne podstawy, aby uznać wariant za patogenny (pewność >99%):

1) PVS1i ?1 × PS1-PS4

2) PVS1 i ?2 × PM1-PM6

3) PVS1 i 1× PM1-PM6 i 1× PP1-PP5

4) PVS1 i ?2 × PP1-PP5

5) ?2× PS1-PS4

6) 1× PS1-PS4 i ?3 PM1-PM6

7) 1× PS1-PS4 i 2× PM1-PM6 i ?2 PP1-PP5

8) 1× PS1-PS4 i 1 ×PM1-PM6 i ?4× PP1-PP5

Potencjalnie patogenny

Punktacja 0,90-0,98; warianty tego typu z wysokim prawdopodobieństwem będą przyczyną choroby, ale nie można sklasyfikować ich jako patogenne.

Przykłady: delecja obejmująca koniec 5' (i fragment sekwencji kodującej) genu, o którym wiadomo, że podlega zjawisku haploinsuficjencji; delecja obejmująca kilka eksonów (i koniec 3') genu, o którym wiadomo, że podlega zjawisku haploinsuficjencji; delecje lub duplikacje genów, które zostały opisane u wielu pojedynczych pacjentów w powiązaniu ze specyficznym fenotypem

Pewność powyżej 90%, że wariant ma charakter patogenny:

1) PVS1 i 1× PM1-PM6

2) 1× PS1-PS4 i 1-2× PM1-PM6

3) 1× PS1-PS4 i ?2× PP1-PP5

4) ?3× PM1-PM6

5) 2× PM1-PM6 i ?2× PP1-PP5

6) 1× PM1-PM6 i ?4× PP1-PP5

Wariant o niepewnym znaczeniu klinicznym

Punktacja od -0,89 do 0,89; szeroka grupa wariantów, które mogą później zostać uznane za patogenne lub łagodne, po spełnieniu dodatkowych warunków.

Przykłady: CNV o znacznej wielkości niezawierający genów; CNV opisany w populacji ogólnej, ale o częstości występowania niższej niż 1%; CNV zawierające kilka genów, o których nie wiadomo, czy są wrażliwe na dawkę; CNV, co do którego są sprzeczne doniesienia w kwestii jego patogenności; CNV w pojedynczym genie, o którym nie wiadomo, czy wpływa na ramkę odczytu

Warianty, których nie da się sklasyfikować w pozostałych kategoriach, dla których powinny zostać podjęte działania mające na celu potwierdzenie lub wykluczenie ich patogennego charakteru, np. analiza segregacji/dziedziczenia wariantu w rodzinie; badania funkcjonalne na poziomie RNA (dla wariantów splicingowych), białka (analiza funkcjonalności/aktywności, jeśli jest taka możliwość), metabolomu (np. w przypadku wrodzonych wad metabolizmu)

Potencjalnie łagodny

Punktacja od -0,90 do -0,98. Warianty z wysokim prawdopodobieństwem klasyfikacji jako łagodne.

Przykłady: warianty, które występują u osób chorych i zdrowych, a różnica w częstości ich występowania w obu grupach nie osiąga znamienności statystycznej; CNV obserwowane często w populacji ogólnej, ale z częstością <1%

Pewność powyżej 90%, że wariant ma charakter łagodny:

1 BS1-BS4 i 1 BP1-BP7

lub

?2 BP1-BP7

Łagodny

Punktacja ?-0,99. Łagodny charakter wariantu nie budzi wątpliwości.

Przykłady: CNV opisany w wielu recenzowanych publikacjach lub bazach danych jako łagodny; CNV będący polimorfizmem, o częstości występowania >1%

Mocne podstawy, aby uznać wariant za łagodny (pewność >99%).

Przykład: warianty występujące z częstością powyżej 5% w populacyjnych bazach danych (UWAGA: często występujące warianty patogenne w niektórych populacjach); lub 2 × BS

[Komentarz: w przypadku klasyfikacji SNV na potrzeby oryginalnej publikacji została opracowana tabela, w której poszczególnym kryteriom nadano odpowiednie skróty; suma poszczególnych kryteriów określa patogenność wariantów.(BA - kryterium łagodne samodzielne; BS - kryterium łagodne silne; BP - kryterium łagodne pomocnicze; PVS - kryterium patogenne bardzo silne; PS - kryterium patogenne silne; PM - kryterium patogenne umiarkowane; PP - kryterium patogenne pomocnicze). Dokładny opis poszczególnych kryteriów znajduje się w publikacji Richards S. i wsp. 2015].

. Zgodnie z nią zidentyfikowany wariant może zostać opisany jako: patogenny, potencjalnie patogenny, wariant o niepewnym znaczeniu klinicznym (VUS), potencjalnie łagodny lub łagodny. Decyzje kliniczne mogą być podejmowane w oparciu o obecność wariantów patogennych/potencjalnie patogennych. W przypadku zidentyfikowania VUS należy podjąć próbę sprawdzenia, czy ma on potencjał do bycia wariantem patogennym. Może to wymagać wykonania analizy dziedziczenia wariantu od biologicznych rodziców dziecka (z możliwością potwierdzenia rodzicielstwa metodami molekularnymi), analizy obecności wariantu u objawowych i bezobjawowych członków rodziny lub nawiązania kontaktu z laboratoriami naukowymi w celu zbadania, czy obecność wariantu może mieć wpływ na zaburzenia składania transkryptu (analiza RNA) lub funkcjonalność białka. Przy klasyfikacji wariantów wykorzystuje się również dedykowane bazy danych zawierające informacje o powiązaniu określonych wariantów z fenotypem (np. ClinVar, OMIM, Online Mendelian Inheritance in Man) lub częstości występowania wariantów w populacjach (gnomAD, Database of Genomic Variants). Korzysta się także z narzędzi predykcyjnych dla mutacji zmiany sensu (missens, np. Mutation Taster, REVEL, MetaRNN, DANN, AlphaMissense) czy mutacji splicingowych (np. Human Splicing Finder, SpliceAI). W przypadku zmian typu CNV można wykorzystywać bazę Decipher czy ClinGen (m.in. określenie wrażliwości genu na dawkę).

Spis stosowanych baz danych, jak również algorytmów automatycznie klasyfikujących warianty, znajduje się w tab. 3.3.

Tabela 3.3. Bazy danych i wybrane programy wykorzystywane w analizach genetycznych

Informacja o fenotypach i powiązanych z nimi genach

Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)

https://omim.org/

Orphanet

https://www.orpha.net/pl

Human Phenotype Ontology (HPO)

https://hpo.jax.org/

PanelApp (UK)

https://panelapp.genomicsengland.co.uk/

PanelApp (Australia)

https://panelapp-aus.org/

PubMed

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/

GeneReviews

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1116/

Informacja o wariantach

ClinVar

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/

Leiden Open Variation Database (LOVD)

https://www.lovd.nl/

Human Gene Mutation Database

https://www.hgmd.cf.ac.uk/

Database of Short Genetic Variations (dbSNP)

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/

gnomAD

https://gnomad.broadinstitute.org/

Database of Genomic Variants

https://dgv.tcag.ca/dgv/app/home

Zbiorcze bazy danych

Decipher

https://www.deciphergenomics.org/

Ensembl

https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index

UCSC Genome Browser

https://genome.ucsc.edu/

Gene

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/

GeneCards

https://www.genecards.org/

Programy do oceny patogenności i weryfikacji nazewnictwa wariantów

GeneBe

https://genebe.net/

Franklin

https://franklin.genoox.com/

Programy do oceny patogenności i weryfikacji nazewnictwa wariantów

VarSome

https://varsome.com/

ClinGen CNV Interpretation Calculator

https://cnvcalc.clinicalgenome.org/cnvcalc/

Mutalyzer

https://mutalyzer.nl/

Variant Validator

https://variantvalidator.org/

Human Splicing Finder (warianty splicingowe)

https://genomnis.com/hsf

SpliceAI (warianty splicingowe)

https://spliceailookup.broadinstitute.org/

Mutation Taster

https://www.mutationtaster.org/

PolyPhen

http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/

Variant Effect Predictor

https://www.ensembl.org/info/docs/tools/vep/index.html

ClinGen

https://clinicalgenome.org/

Decydujące zawsze będzie, czy obecność wariantu w konkretnym genie może być powiązana z objawami obserwowanymi u badanego. Zgodnie z zaleceniami towarzystw naukowych na wyniku badania diagnostycznego powinny się znaleźć wyłącznie warianty powiązane z fenotypem. Raportowanie tzw. przypadkowo wykrytych zmian (incidental findings) w genach z listy ACMG, powiązanych z chorobami, w których podjęcie wczesnej interwencji może przynieść korzyści zdrowotne, powinno być wykonane dopiero po uzyskaniu uświadomionej zgody na ich analizę i uwzględnienie w wyniku badania. Podobnie jest z wariantami warunkującymi nosicielstwo chorób genetycznie uwarunkowanych lub odpowiedzialnych za choroby wieku dorosłego - takie warianty powinny być raportowane wyłącznie u osób dorosłych, które podejmą świadomą decyzję o tym, czy chcą posiadać taką informację.

3.4. Nazewnictwo wariantów

Zidentyfikowane zmiany genetyczne, zarówno aberracje chromosomowe, jak i warianty pojedynczych nukleotydów, muszą zostać w odpowiedni sposób opisane na wyniku badania. W tym celu powołano zespoły, które zajęły się opracowaniem wytycznych, które standaryzują opis wariantów genetycznych.

Zmiany chromosomowe opisywane są zgodnie z wytycznymi zawartymi w International System for Human Cytogenomic Nomenclature (ISCN). System ten zawiera informacje dotyczące opisu poszczególnych prążków chromosomowych, symbole oraz skróty dotyczące zapisu poszczególnych rodzajów wariantów. Ostatnia aktualizacja wytycznych miała miejsce w 2024 r. i związana była z koniecznością uwzględnienia zapisów dotyczących aberracji chromosomowych identyfikowanych z wykorzystaniem nowych technik, jak np. optyczne mapowanie genomu (OGM, optical genome mapping). Wytyczne wydawane są w postaci publikacji książkowej dostępnej w wersji papierowej lub w postaci pliku PDF. Poza zasadami nazewnictwa wariantów w książce znajduje się wiele przykładów zapisu zmian chromosomowych identyfikowanych za pomocą różnych technik cytogenetycznych.

Do opisu wariantów dotyczących zmian w sekwencji nukleotydowej wykorzystuje się system nazewnictwa Human Genome Variation Society (HGVS). Aktualne wytyczne opisane są na stronie internetowej https://hgvs-nomenclature.org/ i zawierają informację dotyczącą zapisu poszczególnych typów wariantów na poziomie chromosomowym, genowym lub białkowym. Obowiązkowy jest zapis wariantu na poziomie DNA, zapis wariantu zaś na poziomie RNA lub białka ma jedynie charakter pomocniczy. Bardzo ważnym elementem zapisu zgodnego z nazewnictwem HGVS jest numer sekwencji referencyjnej, gdyż na jej podstawie projektowane są ewentualne analizy celowane w badaniach rodzinnych. Brak numeru sekwencji referencyjnej może prowadzić do błędów interpretacyjnych i uzyskania nieprawidłowych wyników badań wykonywanych na jego podstawie. Za pomocą nomenklatury HGVS można także opisywać rozległe delecje lub duplikacje, zwłaszcza jeśli znane są koordynaty chromosomowe zmiany. W tym zakresie oba systemy nazewnictwa wariantów dążą do stworzenia wspólnych wytycznych.

Zapis zidentyfikowanego wariantu zgodnie z nomenklaturą ISCN lub HGVS nie zastąpi jego opisu z klasyfikacją patogenności oraz komentarzem dotyczącym jego związku z fenotypem osoby badanej. Zapis wyniku badania cytogenetycznego, w którym zidentyfikowano delecję lub duplikację regionu chromosomowego niepowiązanego ze znanym zespołem mikrodelecji/mikroduplikacji, powinien zawierać przynajmniej listę genów klinicznie znaczących w obrębie zmiany oraz informację o tym, czy CNV go dotyczące może mieć odniesienie w fenotypie.

3.5. Podsumowanie

Diagnostyka genetyczna stanowi ważny element opieki nad pacjentem z chorobą rzadką. Nie zawsze jednak przeprowadzenie badań genetycznych - nawet tych, które umożliwiają analizę całogenomową - umożliwi identyfikację przyczyny wystąpienia choroby. Skuteczność diagnostyczna standardowych testów diagnostycznych (aCGH, Sanger, testy celowane) i sekwencjonowania eksomu szacowana jest odpowiednio na 10-21% i 31-53%. Szacuje się, że sekwencjonowanie genomu z wykorzystaniem krótkich lub długich odczytów zwiększa skuteczność diagnostyczną o kolejne 7-17%. Oznacza to, że mimo wdrożenia szerokiej diagnostyki u części pacjentów nie uda się zidentyfikować genetycznej przyczyny choroby. Część przypadków można wyjaśnić działaniem czynnika niegenetycznego - środowiskowego, np. zakażenia wirusowego, bakteryjnego lub choroby autoimmunologicznej. Dlatego w dalszym ciągu jednym z najważniejszych elementów diagnostyki chorób rzadkich jest dokładny wywiad, który umożliwi wykluczenie nabytego charakteru choroby.

Piśmiennictwo

4AUTOPRZECIWCIAŁA W PRAKTYCE KLINICZNEJ - MOŻLIWOŚĆ ZASTOSOWANIA W DIAGNOSTYCE CHORÓB RZADKICHKatarzyna Fischer, Maciej Leszek Brzosko

4.1. Wstęp

Diagnostyka serologiczna oparta na detekcji autoprzeciwciał jest powszechnie wykorzystywana w praktyce klinicznej. Szczególnie w reumatologii ocena autoprzeciwciał odgrywa niezwykle istotną rolę w procesie diagnostycznym, zwłaszcza we wczesnej fazie choroby lub przy skąpej bądź nietypowej manifestacji klinicznej. Niekiedy stosuje się je także do monitorowania aktywności procesu chorobowego i oceny prognozy. Jednak interpretacja wyników badań serologicznych i ich właściwe osadzenie w kontekście klinicznym może nastręczać wielu trudności. Nakładają się na to m.in. specyfika i heterogenność odpowiedzi immunologicznej, aspekty metodologiczne czy niewystarczająca standaryzacja badań ewaluacyjnych.

W rozdziale dyskutowane są zagadnienia związane z możliwością wykorzystania autoprzeciwciał jako narzędzia diagnostycznego w praktyce klinicznej, z uwzględnieniem szczególnych cech reakcji autoimmunizacyjnej, czynników wpływających na czułość i swoistość tych biomarkerów czy interferujących w metodach laboratoryjnych, a także ogólnych zasad procedury zlecania i interpretacji testów serologicznych.

4.2. Szczególne cechy odpowiedzi autoimmunizacyjnej

Diagnostyka serologiczna jest unikatowa i nieporównywalna z oceną prostych analitów biochemicznych. Biomarkery, takie jak glukoza czy albumina, są jednorodne pod względem cech chemicznych i fizycznych, stąd testy laboratoryjne do ich oceny są równoważne pod względem parametrów technicznych, dając porównywalne wyniki u różnych pacjentów. Odmiennie, autoprzeciwciała reprezentują poliklonalną odpowiedź immunologiczną skierowaną do danego antygenu, warunkowaną przez immunoglobuliny o wysoce heterogennej strukturze i właściwościach, m.in. pod względem stężenia w surowicy, izotypu, glikozylacji fragmentu Fc, docelowych epitopów i ich wewnątrz- i międzykomórkowego rozmieszczenia czy awidności. W konsekwencji profil autoprzeciwciał skierowanych do antygenu X u pacjenta A będzie się różnił od profilu autoprzeciwciał reagujących z antygenem X u pacjenta B.

Ponadto choroby autoimmunizacyjne, a szczególnie choroby układowe tkanki łącznej (ChUTŁ), często reprezentowane są przez szerokie spektrum autoantygenów, co przekłada się na zróżnicowanie profilów serologicznych u poszczególnych chorych z tym samym rozpoznaniem.

Na biologiczną heterogenność odpowiedzi immunologicznej nakładają się także różnice etniczne w ekspresji poszczególnych autoprzeciwciał, co powoduje, że zarówno częstość występowania poszczególnych biomarkerów serologicznych, jak i ich asocjacje kliniczne mogą się znacząco różnić w różnych grupach rasowych.

Heterogenność może przejawiać się także krzyżową reaktywnością wybranych autoprzeciwciał, które mogą rozpoznawać różne białka i wiązać się z nimi. Odwołując się do konkretnych przykładów - przeciwciała przeciw dwuniciowemu DNA (anti-double stranded DNA antibodies, anty-dsDNA), stanowiące podstawowy marker serologiczny tocznia rumieniowatego układowego (TRU), mają zdolność do krzyżowej reaktywności m.in. z ?-aktyniną, co stanowi jeden z patomechanizmów nefropatii toczniowej lub z receptorem NMDA (N-methyl-D-aspartate receptor), co może indukować zaburzenia neuropsychiatryczne, takie jak depresja czy zaburzenia czynności poznawczych. Z kolei krzyżowe reakcje między czynnikiem reumatoidalnym (rheumatoid factor - RF) a antygenem kardiolipinowym prowadzą do fałszywie dodatnich wyników uzyskanych dla przeciwciał antykardiolipinowych (anticardiolipin antibodies - aCL) w klasie IgM.

Heterogenność może także dotyczyć rozpoznawania przez autoprzeciwciała różnie zmodyfikowanych form antygenów. Reakcja z apoptotycznie lub oksydatywnie zmodyfikowaną formą U1-70 kDa wiąże się z różną manifestacją kliniczną.

Wspomniane już różne rozmieszczenie epitopów, wewnątrz- lub międzykomórkowo, może mieć swoje konsekwencje diagnostyczne. Większość przeciwciał przeciwcentromerowych (anti-centromere antibodies - ACA) reaguje z centromerowym białkiem B (CENP-B), jednak w niewielkim procencie stwierdza się reaktywność wyłącznie w stosunku do białka A (CENP-A). Jeżeli zatem zastosujemy testy oparte tylko na CENP-B, uzyskamy w tych przypadkach wynik ujemny.

4.3. Specyfika metod immunologicznych służących do detekcji autoprzeciwciał

Dostępne komercyjnie immunotesty charakteryzują się swoją specyfiką, m.in. pod względem ekspresji epitopów, awidności, wrażliwości na stężenie w surowicy i swoistości izotypowej. W konsekwencji, analizując tę samą próbkę surowicy dodatnią pod względem przeciwciał anty-X, przy użyciu różnych testów immunologicznych służących do detekcji tych przeciwciał, uzyskamy wyniki, które mogą być istotnie odmienne (nie tylko pod względem poziomu wykrytych przeciwciał, lecz także w zakresie klasyfikacji wyniku jako dodatni lub ujemny).

4.3.1. Naturalne autoprzeciwciała

Ważną i mającą istotny wpływ na interpretację wyników badań opartych na immunotestach jest także możliwa interferencja naturalnych autoprzeciwciał stanowiących element prawidłowej odpowiedzi immunologicznej i występujących z dużą częstością w populacji ogólnej. Te immunoglobuliny są produkowane przez limfocyty B1, niepoddane wcześniejszej immunizacji, wywodzące się z genów linii zarodkowej, niezmodyfikowanych przez mutacje indukowane stymulacją antygenową (izohemaglutyniny rozpoznające antygeny grupowe A i B można uznać za prototypowe przeciwciała naturalne). Zwykle obecne są w małym mianie, prezentują słabą awidność i szerokie spektrum krzyżowej reaktywności. To, co szczególnie wpływa na interpretację wyników badań serologicznych, to fakt, że naturalne autoprzeciwciała mogą powodować dodatnią reakcję w bardzo czułych immunotestach, dając często nieoczekiwane wyniki. W szczególności immunotesty fazy stałej, do których należą testy ELISA czy immunoblot, mogą wykrywać przeciwciała o małym stężeniu i niskiej awidności, co często przejawia się nieswoistą reaktywnością w zakresie granicznym lub słabo dodatnim. Dlatego interpretacja wyników badań przeprowadzonych z użyciem takich czułych metod powinna uwzględniać intensywność reaktywności badanej próbki.

4.3.2. Dobór metod immunologicznych

Przewrotna natura autoprzeciwciał i specyfika metod immunologicznych często nakazują stosowanie kilku metod, aby uzyskany wynik cechował się jak największą wiarygodnością.

W przypadku przeciwciał przeciwjądrowych (antinuclear antibodies - ANA) stosuje się zwykle test przesiewowy (czuły) z zastosowaniem metody immunofluorescencji pośredniej na linii komórkowej HEp-2 i test monoswoisty dla potwierdzenia swoistości antygenowej (różne metody).

Innym znakomitym przykładem są wspomniane już anty-dsDNA. Poza znaczeniem diagnostycznym (kryteria klasyfikacyjne TRU) i prognostycznym (związek z wybranymi objawami klinicznymi) mają także znaczenie w monitorowaniu aktywności choroby. Dla celów diagnostycznych powinno się stosować co najmniej dwie metody - ilościową/czułą, np. ELISA, i swoistą - rekomendowany jest test immunofluorescencji pośredniej z użyciem Crithidia luciliae, któremu przypisuje się znaczenie rozstrzygające, zwłaszcza w przypadkach niejednoznacznych lub ujemnych wyników testów ilościowych. Zastosowanie anty-dsDNA do monitorowania przebiegu TRU wymaga uwzględniania ogromnej heterogenności tych autoprzeciwciał, która powoduje, że wyniki uzyskiwane testami różnych producentów mogą się znacząco różnić. Stąd zawsze należy stosować tę samą metodę i przeprowadzać analizę w tym samym laboratorium, aby możliwe było porównanie wyników uzyskanych w różnym czasie u danego chorego.

Heterogenność tej grupy autoprzeciwciał przekłada się wprost na praktykę kliniczną i możliwość zetknięcia się z różnymi, często zaskakującymi scenariuszami:

4.3.3. Czynniki szczególnie wpływające na czułość i swoistość diagnostyczną autoprzeciwciał na przykładzie przeciwciał przeciwjądrowych

Czułość i swoistość diagnostyczna ANA jest zdeterminowana przyjętą wartością odcięcia dla miana autoprzeciwciał, stwierdzonym typem świecenia oraz wstępną oceną kliniczną popartą danymi z wywiadu i badaniem fizykalnym sugerującymi ChUTŁ. Jednym z najczęstszych błędów jest zlecanie tego badania przy braku lub niewielu przesłankach klinicznych. Zlecenie immunotestu na obecność autoprzeciwciał w kontekście małego prawdopodobieństwa klinicznego często generuje nieoczekiwane wyniki dodatnie, które mogą prowadzić do błędnej diagnozy, niewłaściwego leczenia i wzrostu kosztów opieki zdrowotnej. Z drugiej strony, wykrycie specyficznego autoprzeciwciała u osób z niejasno zdefiniowaną chorobą może przyczynić się do wczesnej diagnozy i leczenia, co istotnie wpłynie na lepsze rokowanie. Cienka granica oddzielająca powyższe scenariusze wymaga specjalistycznej wiedzy klinicznej, optymalnej praktyki laboratoryjnej i komunikacji między klinicystą a diagnostą laboratoryjnym.

Ponadto badania przeprowadzone u kobiet diagnozowanych w kierunku TRU wskazały, że dodatnia i ujemna wartość predykcyjna ANA były ściśle zdeterminowane kontekstem klinicznym, w którym badanie było zlecane. Przy skąpych objawach i małym prawdopodobieństwie klinicznym uzyskanie wyniku ujemnego w zakresie ANA zmniejszało szansę rozpoznania TRU do <1%. Natomiast przy typowych objawach i dodatnim wyniku ANA, zwłaszcza w zakresie autoprzeciwciał swoistych dla choroby, takich jak przeciwciała przeciw dsDNA i Sm, szansa na rozpoznanie TRU zwiększała się do ok. 96%.

Jak wspomniano, zarówno miano ANA, jak i typ świecenia mają istotne znaczenie dla czułości i swoistości diagnostycznej testu przesiewowego. Jednak należy pamiętać, że nie istnieje wartość odcięcia dla miana ANA, która miałaby definitywne znaczenie diagnostyczne, zarówno dla metody immunofluorescencji pośredniej, jak i testów fazy stałej. Niewątpliwie małe miana ANA wiążą się z dużą czułością, ale małą swoistością, i odwrotnie - duże miana cechują się większą swoistością kosztem czułości. Ta silna odwrotna zależność czułości i swoistości jest typową cechą diagnostyki serologicznej. Wynik ujemny cechuje się dużą negatywną wartością predykcyjną, a więc ma to istotne znaczenie przy wykluczeniu rozpoznania ChUTŁ czy innej choroby o podłożu autoimmunizacyjnym.

Wynik dodatni musi być interpretowany wraz z typem świecenia. Te najistotniejsze w kontekście rozpoznania zaburzeń o podłożu immunologicznym, w tym ChUTŁ, obejmują typ homogenny, centromerowy, plamkowy (ziarnisty), jąderkowy, typu nuclear dots, błonowy oraz wybrane świecenia cytoplazmatyczne.

Ostatnie analizy wskazują również, że dużą wartość kliniczną ma raportowanie wyników z uwzględnieniem wskaźnika wiarygodności (likelihood ratio - LR), który stanowi miarę dokładności testu przesiewowego/testu diagnostycznego i odzwierciedla stosunek prawdopodobieństwa danego wyniku testu wśród osób z chorobą docelową do prawdopodobieństwa takiego samego wyniku testu wśród osób, u których choroba docelowa nie występuje. W zależności od faktu, czy wynik testu jest ujemny, czy dodatni, mówimy odpowiednio o ujemnym i dodatnim LR. Wskaźniki wiarygodności są wykorzystywane do oceny wartości stosowania testu diagnostycznego oraz mogą być zastosowane do obliczania prawdopodobieństwa występowania u danej osoby choroby docelowej w oparciu o prawdopodobieństwo przedtestowe (prawdopodobieństwo kliniczne, tzw. pre-test probability) u osoby badanej oraz wynik testu. Im wyższy jest dodatni wskaźnik wiarygodności (powyżej 1) oraz im niższy jest ujemny wskaźnik wiarygodności (poniżej 1), tym bogatszy w informacje jest test diagnostyczny odpowiednio - dla potwierdzenia lub wykluczenia choroby. Wskaźniki prawdopodobieństwa dla TRU w zależności od miana ANA na podstawie danych z piśmiennictwa kształtują się następująco:

Analiza wskazuje, że LR zależy od miana ANA i że wynik testu <1:40 ma niższy wskaźnik LR niż wynik testu na poziomie miana 1:40 lub 1:80. Wynik testu <1:40 ma niski LR i wysoką ujemną wartość predykcyjną, a tym samym ogromną przydatność dla wykluczenia choroby.

4.3.4. Wybrane pułapki diagnostyczne

Innym ważnym problemem w codziennej praktyce klinicznej jest wskazanie, jak często należy powtarzać test na obecność autoprzeciwciał u chorych z ustalonym rozpoznaniem ChUTŁ? Odwołując się do przykładu ANA, wskazuje się, że największe znaczenie ma powtarzanie testu w fazie diagnostyki, szczególnie u chorych z utrzymującymi się objawami i małym/średnim mianem autoprzeciwciał. Podkreśla się, że w zaawansowanej fazie choroby ogólny test ANA dość słabo koresponduje z aktywnością procesu chorobowego i możliwością oceny skuteczności leczenia, a jego powtarzanie jest najbardziej uzasadnione w przypadku zmiany obrazu klinicznego, konieczności rewizji diagnozy czy podejrzenia chorób współistniejących.

Niemało trudności interpretacyjnych nastręczają rozbieżności między wynikami badania przesiewowego i testu monoswoistego. W przypadku dodatniego wyniku testu przesiewowego, a ujemnego testu antygenowo swoistego sugeruje się ocenę obecności krążących kompleksów immunologicznych, których miano często jest zwiększone w takich sytuacjach. Ponadto takie rozbieżności nierzadko towarzyszą innym stanom klinicznym, w których ANA mogą być obecne (np. autoimmunizacyjne choroby tarczycy, stwardnienie rozsiane, infekcje, choroby nowotworowe, reakcje polekowe), a także częściej zdarzają się wtedy, kiedy w teście ogólnym miano ANA jest w zakresie wartości małych/średnich. Dodatkowo, należy wziąć pod uwagę, że sytuacja taka może wynikać z faktu, że u chorego obecne są przeciwciała skierowane przeciw innym, nieznanym antygenom, nieuwzględnionym w teście monoswoistym.