3.Ilościowe i jakościowe badania elementów morfotycznych krwi obwodowej: metody manualne i automatyczne

Aleksandra Kubiak, Izabela Zawadzka, Ewelina Ziółkowska

Morfologia krwi obwodowej i rozmaz manualny należą do najczęściej wykonywanych badań laboratoryjnych, umożliwiających kompleksową ocenę układu krwiotwórczego i wskazujących na procesy chorobowe innych narządów przy zachowaniu relatywnie niskich kosztów oznaczenia. Badania te polegają na ilościowej i jakościowej ocenie elementów morfotycznych krwi.

3.1.Metody stosowane w analizatorach hematologicznych

Pierwsze badanie morfologii krwi zostało wykonane w Tybindze w 1852 roku przez niemieckiego lekarza Karla von Vierordta. Polegało ono na pobraniu krwi do kapilary o znanej pojemności, zdmuchnięciu krwi na szklaną płytkę pokrytą cienką warstwą białka, a po wyschnięciu preparatu i umieszczeniu na płytce mikrometru - liczeniu erytrocytów pod mikroskopem. W następnych latach metodę tę udoskonalano, stosując komory pomiarowe wykorzystujące zjawisko rozproszenia światła i pomiar absorpcji. Obecnie działanie nowoczesnych analizatorów hematologicznych opiera się na zaawansowanych technikach pomiarowych, takich jak fluorescencyjna cytometria przepływowa (fluorescence flow cytometry, FFC) oraz metoda detekcji z użyciem prądu osłaniającego i prądu stałego (direct current, DC). Analizowane próbki są aspirowane przez analizator i rozdzielane na kilka małych porcji. Pomiar cech swoistych dla różnych rodzajów komórek jest możliwy dzięki wykorzystaniu rozmaitych technologii pomiarowych i działaniu specyficznych odczynników stosowanych w niezależnych kanałach pomiarowych.

Parametry morfologii krwi mogą być bezpośrednio oznaczane przez analizatory hematologiczne lub wyliczane.

Bezpośrednio oznaczane są:

- liczba krwinek czerwonych (RBC[1]);

- liczba krwinek białych (WBC);

- liczba płytek (PLT);

- stężenie hemoglobiny (Hb).

Do parametrów wyliczanych należą:

- średnia masa hemoglobiny w krwince (MCH);

- średnie stężenie hemoglobiny w krwince (MCHC);

- rozpiętość rozkładu wielkości krwinek czerwonych (RDW).

Niektóre parametry, takie jak średnia objętość krwinek czerwonych (MCV) i hematokryt (HCT), mogą być zarówno oznaczane bezpośrednio, jak i wyliczane (tab. 3.1).

Istnieje kilka metod oznaczania parametrów hematologicznych. Należą do nich m.in. takie metody, jak:

- spektrofotometryczna;

- impedancyjna;

- optyczna;

- fluorescencyjnej cytometrii przepływowej.

TABELA 3.1.

Porównanie parametrów wyliczanych i oznaczanych przez analizatory hematologiczne

Parametry hematologiczne oznaczane

Parametry hematologiczne wyliczane

Liczba krwinek czerwonych (RBC)

Średnia masa hemoglobiny w krwince (MCH)

MCH [pg] = Hb / RBC

Liczba krwinek białych (WBC)

Średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej (MCHC)

MCHC [g/dl] = Hb / HCT

Liczba płytek (PLT)

Rozpiętość rozkładu wielkości krwinek czerwonych (RDW)

Hemoglobina (Hb)

Objętość krwinek czerwonych (MCV)

MCV [fl] = HCT / RBC

Objętość krwinek czerwonych (MCV)

Hematokryt (HCT)

Hematokryt (HCT)

Objaśnienie skrótów: zob. tab. 1.

Metoda spektrofotometryczna

Spektrofotometria jest jedną z najstarszych metod instrumentalnych. Polega na ilościowym pomiarze odbitego lub zaabsorbowanego światła przez badaną próbkę, w której dochodzi do absorpcji promieniowania elektromagnetycznego w zakresie promieniowania widzialnego i nadfioletowego.

W diagnostyce hematologicznej metoda ta jest wykorzystywana m.in. do pomiaru stężenia hemoglobiny (Hb). Na pierwszym etapie krwinki czerwone są poddawane lizie. Uwolniona hemoglobina ulega przemianie w chromogen, którego absorbancja jest mierzona przy długości fali 540 nm.

Opisana metoda została udoskonalona dzięki zastosowaniu laurylosiarczanu sodu (sodium lauryl sulfate, SLS), który minimalizuje wpływ zmętnienia próbki w wyniku np. lipemii lub podwyższonej leukocytozy. W metodzie tej SLS lizuje krwinki czerwone i krwinki białe. W trakcie reakcji chemicznej dochodzi do utlenienia grupy hemowej, do której przyłączają się hydrofilowe grupy SLS, a powstający w ten sposób barwny kompleks SLS-Hb pochłania światło wysyłane przez diodę LED zamontowaną w aparacie pomiarowym. Czujnik fotoelektryczny mierzy absorbancję, która jest proporcjonalna do stężenia Hb w próbce.

Metoda impedancyjna

Impedancja charakteryzuje zależność między natężeniem prądu i napięciem w obwodach prądu zmiennego i odpowiada oporowi elektrycznemu w obwodach prądu stałego. W hematologii metoda impedancyjna wykorzystuje pole elektryczne wytworzone między dwiema elektrodami o przeciwnym ładunku i służy do zliczania komórek oraz określania ich wielkości.

Roztwór, w którym komórki są zawieszone, jest dobrym przewodnikiem prądu, podczas gdy komórki - jako słabe przewodniki elektryczne - przepływając w szczelinie między elektrodami, zwiększają opór, czyli impedancję, co powoduje powstawanie impulsu elektrycznego proporcjonalnego do rozmiaru elementu, który go wygenerował. Zmiana impedancji jest proporcjonalna do liczby i objętości przepływających przez szczelinę komórek, a wysokość piku, będącego zobrazowaniem siły impulsu - do objętości komórki. Impulsy przedstawiane są w formie graficznej na histogramach (ryc. 3.1). Stosunek skumulowanej lub całkowitej wartości poszczególnych pików (odpowiadających objętości krwinek czerwonych) do całkowitej objętości płynu poddanego analizie odpowiada wartości HCT. Metoda ta jest ponadto wykorzystywana do oznaczania liczby RBC i PLT. W metodzie impedancyjnej czynnikami, które najczęściej odpowiadają za fałszywe wyniki, są fragmenty erytrocytów i płytki olbrzymie.

Metoda optyczna

W metodzie optycznej mierzone jest światło rozproszone czołowo, a sygnał zależy od wielkości i gęstości badanych komórek. Metoda ta nie wymaga lizy erytrocytów. W hematologii jest wykorzystywana głównie do oznaczenia liczby retikulocytów, ale stanowi także jedną z metod służących do oznaczania liczby PLT.

W metodzie tej kwas rybonukleinowy (ribonucleic acid, RNA), odpowiednio retikulocytów lub płytek krwi, jest wybarwiany za pomocą barwnika fluorescencyjnego, po czym wybarwione elementy są różnicowane z erytrocytami za pomocą różnic w intensywności fluorescencji.

Optyczne oznaczanie liczby płytek jest szczególnie użyteczne w przypadku występowania we krwi mikrocytów, które w metodzie impedancyjnej mogą fałszywie zawyżać liczbę PLT. Metoda optyczna może ponadto służyć do wyliczenia zawartości Hb w erytrocytach na podstawie pomiaru światła rozproszonego czołowo (odbitego od erytrocytów) oraz całkowitej liczby erytrocytów. Wyliczana w ten sposób zawartość Hb dotyczy tylko erytrocytów, które nie uległy lizie, zatem może być użyteczna u pacjentów z podejrzeniem hemolizy in vivo.

Metoda fluorescencyjnej cytometrii przepływowej (FFC)

Metoda ta wykorzystuje pomiar komórek przepływających w uporządkowany sposób w strumieniu cieczy przez wiązkę lasera. Dla każdej przepływającej komórki rejestrowane są sygnały rozproszenia światła i sygnały fluorescencji. O wielkości mierzonego obiektu informuje pomiar światła rozproszonego czołowo (forward scatter, FS), natomiast o wewnętrznej strukturze - pomiar światła rozproszonego bocznie (side scatter, SS), wykrywanego przez detektor wzmacniający sygnał, tzw. fotopowielacz.

Komórki poddawane są działaniu odczynników lizujących, powodujących perforację ich błony komórkowej. Sposób perforacji błony zależy od rodzaju komórki, jej dojrzałości i stanu aktywacji. Tak przygotowane komórki inkubowane są z barwnikami fluorescencyjnymi skierowanymi do wybranych struktur komórkowych, dzięki czemu możliwe jest uzyskanie o nich unikatowej i specyficznej informacji. Barwnik fluorescencyjny, aby mógł wyemitować światło fluorescencyjne, musi osiągnąć wyższy poziom energetyczny dzięki absorbcji energii świetlnej emitowanej przez laser. Stężenie analizowanej substancji odpowiada proporcjonalnie zarówno ilości światła zaabsorbowanego, jak i wyemitowanego. Emitowane światło fluorescencyjne mierzone jest ponownie przez fotopowielacz, przy czym ma ono inną długość fali niż światło rozproszone. Dlatego pomiary te zachodzą niezależnie i nie interferują wzajemnie. Rejestrowane dla każdej komórki sygnały są następnie cyfrowo przetwarzane na wykresy rozproszenia, tzw. skatergramy, przedstawiające szczegółowo profil badanych komórek (ryc. 3.2).

Stosowane obecnie analizatory hematologiczne wykorzystują tę metodę do rozdziału krwinek białych na pięć podstawowych frakcji (5-DIFF) oraz do zliczenia:

- liczby (odsetka) niedojrzałych granulocytów;

- komórek atypowych (np. limfocytów reaktywnych, komórek białaczkowych);

- retikulocytów (RET);

- zawartości hemoglobiny w retikulocytach (RET-Hb);

- prekursorów krwinek czerwonych (nucleated red blood cell, NRBC);

- PLT.

? Copyright by Wydawnictwo Naukowe PWN S.A., Warszawa 2023

Wszystkie prawa zastrzeżone. Przedruk i reprodukcja w jakiejkolwiek postaci całości bądź części książki bez pisemnej zgody wydawcy są zabronione.

Autorzy i Wydawnictwo dołożyli wszelkich starań, aby wybór i dawkowanie leków w tym opracowaniu były zgodne z aktualnymi wskazaniami i praktyką kliniczną. Mimo to, ze względu na stan wiedzy, zmiany regulacji prawnych i nieprzerwany napływ nowych wyników badań dotyczących podstawowych i niepożądanych działań leków, Czytelnik musi brać pod uwagę informacje zawarte w ulotce dołączonej do każdego opakowania, aby nie przeoczyć ewentualnych zmian we wskazaniach i dawkowaniu. Dotyczy to także specjalnych ostrzeżeń i środków ostrożności. Należy o tym pamiętać, zwłaszcza w przypadku nowych lub rzadko stosowanych substancji.

Recenzent: Prof. dr hab. n. med. Ewa Lech-Marańda, konsultant krajowy w dziedzinie hematologii

Wydawca: Anna Plewa

Redaktor prowadzący: Barbara Nowak-Pacholczak

Redaktor merytoryczny: Magdalena Mendys

Producent: Marta Kubica

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwo Naukowe PWN S.A. Michał Latusek

Projekt okładki i stron tytułowych: Lidia Michalak-Mirońska

Ilustracja na okładce: yodiyim/123RF

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2023r. (Wydanie I)Warszawa 2023

PZWL Wydawnictwo Lekarskie

ISBN 978-83-01-22943-6

DOI: https://doi.org/10.53271/2022.132

Wydawnictwo Naukowe PWN S.A.

ul. G. Daimlera 2

02-460 Warszawa

pwn.pl

Księgarnia wysyłkowa:

tel. 42 680 44 88; infolinia: 801 33 33 88

e-mail: [email protected]

Informacje w sprawie współpracy reklamowej: [email protected]

AUTORZY

Dr hab. n. med. Maria Bieniaszewska

Katedra i Klinika Hematologii i Transplantologii, Gdański Uniwersytet Medyczny

Prof. dr hab. n. med. Krzysztof Chojnowski

Zakład Zaburzeń Hemostazy, Katedra Hematologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Dr n. med. Magdalena Czemerska

Katedra i Klinika Hematologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Prof. dr hab. n. med. Anna Czyż

Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

Dr n. med. Anna Dukat-Mazurek

Katedra i Zakład Immunologii Medycznej, Gdański Uniwersytet Medyczny

Dr n. med. Agnieszka Gierszon

Pracownia Immunologii Leukocytów i Płytek Krwi, Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej, Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie

Lek. Patrycja Goczewska

Laboratorium Hematologii, Uniwersyteckie Centrum Kliniczne w Gdańsku

Prof. dr hab. n. med. Joanna Góra-Tybor

Klinika Hematologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Prof. dr hab. n. med. Anna Korycka-Wołowiec

Katedra i Klinika Hematologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Dr n. med. Anna Krawczyńska

Katedra i Klinika Hematologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Lek. Kinga Krawiec

Katedra i Klinika Hematologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Dr n. med. Aleksandra Kubiak

Katedra i Klinika Hematologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Dr hab. n. med. Krzysztof Lewandowski

Zakład Medycyny Laboratoryjnej, Gdański Uniwersytet Medyczny

Dr n. med. Agnieszka Lipniacka

Pracownia Genetyki Hemostazy i Porfirii, Zakład Hemostazy i Chorób Metabolicznych, Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie

Prof. dr hab. n. med. Magdalena Łętowska

Zastępca Dyrektora ds. Transfuzjologii, Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie

Dr hab. n. med. Andrzej Mital

Katedra i Klinika Hematologii i Transplantologii, Gdański Uniwersytet Medyczny

Dr hab. n. med. Grażyna Moszkowska

Katedra i Zakład Immunologii Medycznej, Gdański Uniwersytet Medyczny

Dr n. med. Weronika Nowak

Zakład Zaburzeń Hemostazy, Katedra Hematologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Dr n. med. Mateusz Nowicki

Klinika Hematologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi; Oddział Hematologii i Transplantologii, Wojewódzkie Wielospecjalistyczne Centrum Onkologii i Traumatologii im. Mikołaja Kopernika w Łodzi

Dr n. med. Edyta Odnoczko

Pracownia Genetyki Hemostazy i Porfirii, Zakład Hemostazy i Chorób Metabolicznych, Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie

Dr n. med. Monika Pelc-Kłopotowska

Pracownia Immunologii Krwinek Czerwonych, Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej, Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie

Dr hab. n. med. Agnieszka Pluta

Katedra i Klinika Hematologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Prof. dr hab. n. med. Maria Podolak-Dawidziak

Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

Prof. dr hab. n. med. Ewa Robak

Klinika Dermatologii i Wenerologii, Uniwersyt Medyczny w Łodzi

Dr n. med. Ewa Studniak

Pracownia Cytogenetyki, Klinika Hematologii z Oddziałem Transplantologii Szpiku, Samodzielny Szpital Kliniczny Nr 1 PUM im. prof. Tadeusza Sokołowskiego w Szczecinie

Dr hab. n. med. Anna Szmigielska-Kapłon, prof. UM

Klinika Hematologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi; Oddział Hematologii i Transplantologii, Wojewódzkie Wielospecjalistyczne Centrum Onkologii i Traumatologii im. Mikołaja Kopernika w Łodzi

Dr n. med. Donata Szymczak

Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

Lek. Michał Taszner

Katedra i Klinika Hematologii i Transplantologii, Gdański Uniwersytet Medyczny

Mgr Izabela Topolewska

Centralne Laboratorium Kliniczne, Uniwersyteckie Centrum Kliniczne w Gdańsku

Prof. dr hab. n. med. Jacek Treliński

Zakład Zaburzeń Hemostazy, Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Dr n. med. Iwona Urbanowicz

Katedra Analityki Medycznej, Zakład Chemii Klinicznej i Hematologii Laboratoryjnej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

Prof. dr hab. n. med. Lidia Usnarska-Zubkiewicz

Klinika Hematologii Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku, Uniwersytet Medyczny

im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

Dr n. med. Robert Wasilewski

Klinika Zaburzeń Hemostazy i Chorób Wewnętrznych, Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie

Dr n. med. Ewa Wawrzyniak

Katedra i Klinika Hematologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Prof. dr hab. n. med. Dariusz Wołowiec

Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

Prof. dr hab. n. med. Tomasz Wróbel

Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

Prof. dr hab. n. med. Jan Maciej Zaucha

Klinika Hematologii i Transplantologii, Uniwersyteckie Centrum Kliniczne w Gdańsku

Dr n. med. Izabela Zawadzka

Synevo Laboratorium Centralne w Łodzi

Prof. dr hab. n. med. Izabela Zawlik

Zakład Genetyki Ogólnej, Instytut Nauk Medycznych, Laboratorium Biologii Molekularnej, Przyrodniczo-Medyczne Centrum Badań Innowacyjnych, Kolegium Nauk Medycznych, Uniwersytet Rzeszowski

Lek. Krzysztof Zduniak

Zakład Patomorfologii, Dolnośląskie Centrum Onkologii, Pulmonologii i Hematologii we Wrocławiu

Dr n. med. Joanna Zdziarska

Klinika Hematologii, Szpital Uniwersytecki w Krakowie

Dr n. med. Hanna Zielińska

Katedra i Zakład Immunologii Medycznej, Gdański Uniwersytet Medyczny

Dr n. med. Ewelina Ziółkowska

Katedra i Klinika Hematologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi

PRZEDMOWA

Hematologię jako osobną dziedzinę medycyny wyodrębniono z chorób wewnętrznych w połowie XX wieku. Od początku była to specjalizacja kliniczno-laboratoryjna, a podstawowa diagnostyka opierała się na morfologii oraz ocenie mikroskopowej preparatów krwi obwodowej i szpiku kostnego. Wraz z rozwojem biochemii, biologii i biologii molekularnej wprowadzano nowe, coraz bardziej specjalistyczne metody badania materiału biologicznego, w tym krwi. Zaczęto organizować pierwsze laboratoria diagnostyczne, a świadomość lekarzy co do znaczenia badań laboratoryjnych w rozpoznawaniu i różnicowaniu chorób układu krwiotwórczego stopniowo wzrastała. Współczesna hematologia obejmuje zarówno nienowotworowe, jak i nowotworowe choroby układu krwiotwórczego, które niekiedy rozpoczynają się bezobjawowo i są rozpoznawane przypadkowo przy okazji badań laboratoryjnych wykonanych w innym celu. Prawidłowe rozpoznanie choroby, zastosowanie właściwego leczenia i oceny jego efektów, w tym monitorowanie mierzalnej choroby resztkowej nie byłyby dziś możliwe bez cytogenetycznych, molekularnych i immunofenotypowych badań laboratoryjnych wykonywanych przez wykwalifikowanych diagnostów.

Książka, którą oddajemy do Państwa rąk, jest adresowana przede wszystkim do diagnostów laboratoryjnych, osób specjalizujących się w laboratoryjnej diagnostyce hematologicznej oraz studentów analityki medycznej oddziału medycyny laboratoryjnej. Głównym jej przesłaniem jest również zapoznanie diagnostów z kliniką chorób, w rozpoznawaniu których uczestniczą. Mamy nadzieję, że książka okaże się także przydatna dla lekarzy i studentów medycyny, przybliżając im zasady prawidłowej interpretacji badań laboratoryjnych, jak również techniki wykonywania badań, niekiedy bardzo praco- i czasochłonne. Chcemy w ten sposób pokazać, dlaczego nie zawsze jest możliwe skrócenie czasu oczekiwania na wynik. Na rynku wydawniczym nie ma dotychczas podręcznika przedstawiającego panel badań laboratoryjnych, niezbędnych do rozpoznania chorób układu krwiotwórczego, w kontekście podstawowych wiadomości klinicznych, w tym ich etiopatogenezy i symptomatologii. Chcielibyśmy, żeby książka ta uwrażliwiła diagnostów na ryzyko wystąpienia błędów i pułapek laboratoryjnych oraz na sytuacje, w których istnieje konieczność pilnego kontaktu z lekarzem zlecającym badanie. Pragnęlibyśmy również, aby pomogła lekarzom we właściwej interpretacji badań laboratoryjnych i przyczyniła się do lepszego zrozumienia konieczności ścisłej współpracy między lekarzem a diagnostą laboratoryjnym w celu usprawnienia procesu diagnostycznego.

Pomysł napisania tej książki zrodził się z przekonania, że warunkiem koniecznym powodzenia leczenia pacjentów hematologicznych jest prawidłowe ustalenie rozpoznania, które nie jest obecnie możliwe bez specjalistycznego laboratorium diagnostycznego, zatrudniającego dobrze przygotowanych diagnostów, specjalistów z zakresu cytologii, cytogenetyki, cytometrii czy biologii molekularnej.

Redaktorami naukowymi książki są lekarze hematolodzy oraz diagności specjalizujący się w rozpoznawaniu chorób hematologicznych. Autorami poszczególnych rozdziałów są lekarze i diagności laboratoryjni mający wieloletnie doświadczenie w omawianych metodach diagnostycznych i znaczny dorobek naukowy.

Treść książki jest podzielona na sześć części. Pierwsza część stanowi wprowadzenie do zagadnień omawianych w publikacji i zawiera wykaz skrótów stosowanych na wynikach morfologii wraz z zakresem wartości referencyjnych. W drugiej omawiamy główne metody diagnostyczne stosowane w hematologii laboratoryjnej, zwracając uwagę na ich zastosowanie oraz czułość i specyficzność. W trzeciej i czwartej części prezentujemy najważniejsze wiadomości dotyczące etiopatogenezy i obrazu klinicznego nienowotworowych i nowotworowych chorób hematologicznych ze szczególnym uwzględnieniem właściwego podejścia diagnostycznego. Przedstawiamy panel badań, które powinny być wykonane w poszczególnych jednostkach chorobowych, zwracając uwagę na ewentualne pułapki laboratoryjne w interpretacji ich wyników. Rozwój nowoczesnych metod diagnostycznych spowodował zmiany w podejściu do roli badań diagnostycznych w rozpoznawaniu chorób układu krwiotwórczego, co znajduje odzwierciedlenie w opracowywanych przez Światową Organizację Zdrowia (World Health Organization, WHO) nowych klasyfikacjach chorób hematologicznych, które w coraz większym stopniu opierają się na badaniach molekularnych i cytogenetycznych. W książce prezentujemy kliniczno-diagnostyczną charakterystykę chorób według najnowszej klasyfikacji WHO 2022 oraz klasyfikacji ICC (International Consensus Classificacion) 2022. Osobną część stanowią zagadnienia związane z zaburzeniami hemostazy osoczowej. Ostatnia, szósta część publikacji poświęcona jest roli diagnosty w organizacji, przeprowadzeniu i monitorowaniu przeszczepień komórek krwiotwórczych, które odgrywają coraz większą rolę w leczeniu chorób onkohematologicznych. Chcemy także przybliżyć najnowocześniejsze metody stosowane coraz szerzej w transplantologii hematologicznej, polegające na wykorzystaniu terapii CART (chimeric antigen receptors T cell therapy).

Chociaż wiele miejsca poświęciliśmy opisowi metod rozpoznawania chorób hematologicznych realizowanych przez diagnostów laboratoryjnych, książka nie jest podręcznikiem technik laboratoryjnych i nie zastąpi opisu procedur obowiązujących w danym laboratorium. Podobnie zakresy wartości referencyjnych różnych parametrów laboratoryjnych mogą się różnić między pracowniami i mogą być nieco inne niż przedstawione w niniejszej książce. Ze względu na ograniczenia wydawnicze zrezygnowaliśmy też ze zdjęć preparatów cytologicznych komórek krwi i szpiku w stanach patologicznych, które Czytelnik może znaleźć bez trudności w już istniejących na rynku atlasach cytologicznych.

Zdajemy sobie sprawę, że nie jest możliwe, aby wyczerpująco omówić wszystkie zagadnienia związane z coraz dynamiczniej rozwijającą się diagnostyką hematologiczną. Mamy jednak nadzieję, że książka ta będzie pomocna w codziennej pracy diagnostyczno-terapeutycznej - zarówno diagnostów laboratoryjnych, jak i lekarzy - i że spotka się z życzliwym i przychylnym przyjęciem.

Życzymy owocnej lektury.

Annna Korycka-Wołowiec,

Krzysztof Lewandowski,

Dariusz Wołowiec

Wykaz skrótów stosowanych na wynikach morfologii i zakres najczęściej spotykanych wartości referencyjnych

Anna Korycka-Wołowiec

Wynik badania laboratoryjnego to konkretna wartość liczbowa, przedstawiona najczęściej w jednostkach układu SI (fr. syst?me international d'unités). Wartość ta mieści się w zakresie norm przyjętych przez dane laboratorium (tzw. wartości referencyjne) lub wykracza poza nie, niosąc bardzo ważną, choć niejednokrotnie trudną do interpretacji informację. Niektóre laboratoria przedstawiają wyniki w jednostkach spoza układu SI i w takich sytuacjach przydatna jest znajomość wzorów pozwalających na przeliczenie otrzymanych wartości na wartości z układu SI.

W tabeli 1 przedstawiono wykaz skrótów stosowanych na wynikach morfologii i zakres wartości referencyjnych.

TABELA 1.

Wykaz skrótów używanych na wynikach morfologii i zakres najczęściej stosowanych wartości referencyjnych

Parametr

Objaśnienie

Zakres wartości referencyjnych (w jednostkach tradycyjnych)

Zakres wartości referencyjnych (w jednostkach SI)

Parametry czerwonokrwinkowe

RBCs

(red blood cells)

Bezwzględna liczba erytrocytów w jednostce objętości; zależy od płci

3,5-5,2

4,2-5,6

Dzieci: 3,5-5,4 [mln/?l]

3,5-5,2

4,2-5,6

Dzieci: 3,5-5,4

[× 1012/l; T/l]

Hb

(hemoglobin)

Stężenie hemoglobiny w pełnej krwi; zależy od płci

11,5-15,0

13,5-17,0

Dzieci: 10-15 [g/dl]

115-150

135-170

Dzieci: 100-150 [g/l]

HCT

(hematocrit)

Stosunek objętości erytrocytów do objętości krwi pełnej; zależy od płci

36-48

40-52

Dzieci: 30-40 [%]

0,36-0,48

0,40-0,52

Dzieci: 0,30-0,40 [l/l]

MCV

(mean corpuscular volume)

Średnia objętość krwinki czerwonej

80-100 [?m3]

80-100 [fl]

MCH

(mean corpuscular hemoglobin)

Średnia masa

hemoglobiny w

krwince czerwonej

26-34 [pg]

1,7-2,1 [fm]

Parametry czerwonokrwinkowe

MCHC

(mean corpuscular hemoglobin concentration)

Średnie stężenie hemoglobiny w erytrocytach - masa hemoglobiny zawartej w 100 ml krwinek czerwonych

31-37 [g/dl]

19-23 [mmol/l]

RDW-SD i RDW-CV (red blood cell distribution width)

Wskaźnik rozrzutu wielkości erytrocytów wyrażony w fl jako ?3 odchylenia standardowe od MCV (RDW-SD) lub jako stosunek RDW-SD do MCV wyrażony w procentach (RDW-CV); jest miarą anizocytozy

37-46 [?m3]

11-16 [%]

37-46 [fl]

11-16 [%]

RET

(reticulocytes)

Liczba retykulocytów w jednostce objętości krwi (retykulocytoza bezwzględna) lub liczba retykulocytów na 1 tys. dojrzałych erytrocytów (retykulocytoza względna)

20-100 (tys/?l)

5-15 [?]

20-100 [× 109/l; G/l]

5-15 [?]

HFR

(high fluorescence reticulocytes)

Odsetek retikulocytów najmłodszych (o wysokiej fluorescencji) w stosunku do całej ich populacji

0-1,4 [%]

0-1,4 [%]

MFR

(medium fluorescence reticulocytes)

Odsetek retykulocytów średnio dojrzałych (o pośredniej fluorescencji) w stosunku do całej ich populacji

1,5-11,3 [%]

1,5-11,3 [%]

LFR

(low fluorescence reticulocytes)

Odsetek retikulocytów dojrzałych (o niskiej fluorescencji) w stosunku do całej ich populacji

86,5-98,5 [%]

86,5-98,5 [%]

IFR

(immature reticulocytes fraction)

Łączny odsetek retikulocytów młodych i średnio dojrzałych (HFR + MFR)

1,5-12,7 [%]

1,5-12,7 [%]

RET-Hb

(reticulocyte hemoglobin equivalent)

Średnia masa hemoglobiny w retikulocycie

28-35 [pg]

1,7-2,1 [fm]

NRBC

(nucleated red blood cells)

Komórki układu czerwonokrwinkowego zawierające jądra (erytroblasty)

Nieobecne

Nieobecne

Parametry białokrwinkowe

WBC

(white blood cells)

Liczba krwinek białych (leukocytów) w jednostce objętości krwi

4-10

Dzieci > 10 lat 4,5-13,5 [tys./?l]

4-10 [× 109/l; G/l]

NEUT

(neutrophils)

Liczba granulocytów obojętnochłonnych w jednostce objętości krwi (absolute neutrophic count, ANC) lub odsetek granulocytów obojętnochłonnych w całej populacji leukocytów

1,8-7,5 [tys./?l]

45-75 [%]

1,8-7,5 [× 109/l; G/l]

45-75 [%]

EOS

(eosinophils)

Liczba granulocytów kwasochłonnych w jednostce objętości krwi lub odsetek eozynofilów w całej populacji leukocytów

0,01-0,5 [tys./?l]

1-5 [%]

0,01-0,5 [× 109/l; G/l]

1-5 [%]

BASO

(basophils)

Liczba granulocytów zasadochłonnych w jednostce objętości krwi lub odsetek bazofilów w całej populacji leukocytów

< 0,01 [tys./?l]

0-1 [%]

< 0,01 [× 109/l; G/l]

0-1 [%]

LYMPH

(lymphocytes)

Liczba limfocytów w jednostce objętości krwi lub ich odsetek w całej populacji leukocytów

1,5-4,5 [tys./?l]

20-45 [%]

1,5-4,5 [× 109/l; G/l]

20-45 [%]

MONO

(monocytes)

Liczba monocytów w jednostce objętości krwi lub ich odsetek w całej populacji leukocytów

0,2-0,8 [tys./?l]

3-10 [%]

0,2-0,8 [× 109/l; G/l]

3-10 [%]

MID

(middle cells)

Komórki niebędące neutrofilami ani limfocytami (odsetek w populacji leukocytów)

< 9-11 [%]

< 9-11 [%]

IG

(immature granulocytes)

Niedojrzałe granulocyty (odsetek w populacji leukocytów)

0,2-0,5 [%]

0,2-0,5 [%]

LIC

(large immature cells)

Duże niedojrzałe komórki

(odsetek w populacji leukocytów)

< 0,8 [%]

ALY

(atypical lymphocytes)

Atypowe limfocyty (odsetek w populacji leukocytów)

< 0,6 [%]

Parametry płytek krwi

PLT

(platelets)

Liczba płytek krwi w jednostce objętości krwi

150-400 [tys./?l]

150-400 [× 109/l; G/l]

MPV

(mean platelet volume)

Średnia objętość płytki krwi

8-12 [?m3]

8-12 [fl]

PDW

(platelets distribution width)

Wskaźnik anizocytozy płytek krwi, zróżnicowanie płytek pod względem objętości

9-14 [?m3]

9-14 [fl]

PCT (plateletcrit)

Płytkokryt, stosunek objętości masy płytkowej do całkowitej objętości krwi

0,2-0,4 [%]

0,2-0,4 [%]

P-LCR (platelet large cell ratio)

Odsetek dużych płytek o objętości > 12 fl

15-43 [%]

15-43 [%]

Najważniejsze wzory pozwalające w przybliżony sposób na kontrolę wiarygodności wyniku morfologii:

- HCT [%] ? 3 × Hb [g/dl]

- Hb [g/dl] ? 3 × RBC [× 1012/l]

- MCV [fl] = [HCT (%) × 10]/RBC [× 1012/l]

- MCH [pg] = [Hb( g/dl) × 10]/RBC [× 1012/l]

- MCHC [g/dl] = [Hb (g/dl) × 100]/HCT [%]

- Hb [g/dl] = Hb [mmol/l] × 1,611

1.Diagnosta laboratoryjny jako partner lekarza klinicysty w diagnostyce i leczeniu chorób hematologicznych

Anna Korycka-Wołowiec

Dynamiczny rozwój szczególnie biologii molekularnej i inżynierii genetycznej spowodował, że współczesna diagnostyka chorób układu krwiotwórczego jest oparta na specjalistycznych badaniach wykonywanych przez wykwalifikowanych diagnostów laboratoryjnych. W 1977 roku na wydziałach farmaceutycznych ówczesnych akademii medycznych utworzono kierunek "analityka medyczna". Obecnie przyszli diagności kształcą się na oddziałach medycyny laboratoryjnej wydziałów farmaceutycznych uniwersytetów medycznych i są przygotowywani do roli partnerów lekarzy klinicystów w rozpoznawaniu chorób hematologicznych i monitorowaniu ich leczenia. Przez wiele lat rola diagnosty polegała jedynie na mechanicznym wykonywaniu badań zleconych przez lekarzy. W związku z zachodzącymi zmianami w programie nauczania, większym upraktycznieniem studiów na kierunku "analityka medyczna" i coraz lepszym przygotowaniem merytorycznym studentów, jak również rosnącą świadomością lekarzy co do konieczności korzystania z wiedzy diagnostów i traktowania ich jako partnerów, a nie wyłącznie wykonawców ich zleceń, miejsce diagnostów w zespołach terapeutycznych zaczęło się stopniowo zmieniać. Ich praca w ogólnym laboratorium hematologicznym nie jest już ograniczona do odczytywania wyników z próbek umieszczanych w coraz bardziej nowoczesnych i zautomatyzowanych analizatorach hematologicznych. Diagności potrafią wykrywać i analizować ewentualne artefakty wynikające z błędów fazy przedanalitycznej i analitycznej, informują lekarza zlecającego badanie o konieczności jego powtórzenia i jako pierwsi, widząc wynik budzący niepokój, zgłaszają to lekarzowi.

Podstawowymi badaniami wykonywanymi w diagnostyce hematologicznej są:

- morfologia z rozmazem;

- mielogram;

- wybrane parametry biochemiczne.

Badanie morfologii jest wykonywane w każdym laboratorium diagnostycznym, a jego wynik może wskazywać na wiele procesów chorobowych, w tym dotyczących układu krwiotwórczego. Aparaty starszej generacji, tzw. 3 diff, określały tylko najbardziej podstawowe parametry czerwonokrwinkowe, liczbę płytek krwi oraz liczbę leukocytów z rozdziałem na trzy frakcje: neutrofile, limfocyty i tzw. MID (middle cells), obejmujące krwinki jednojądrowe średniej wielkości, do których zalicza się monocyty, eozynofile, bazofile oraz młodsze komórki układu granulocytarnego. Używane obecnie w większości laboratoriów nowoczesne analizatory hematologiczne stwarzają możliwość oceny znacznie większej liczby parametrów i pozwalają diagnoście na szybkie wykrywanie ewentualnych błędów fazy przedanalitycznej i analitycznej, a jego ścisły kontakt z lekarzem klinicystą umożliwia prawidłową interpretację uzyskanych wyników.

Ogromne znaczenie ma nadal fachowa ocena zarówno rozmazów krwi obwodowej, jak i szpiku kostnego dokonywana na podstawie prawidłowo wykonanych i zabarwionych preparatów cytologicznych. Niezwykle istotne jest wychwycenie przez diagnostę zmian patologicznych w rozmazie mikroskopowym krwi obwodowej i, w razie potrzeby, pilne poinformowanie o tym lekarza zlecającego badanie. Ma to ogromne znaczenie szczególnie w przypadku chorób zagrażających życiu. Na przykład obecność schistocytów w rozmazie krwi obwodowej u kobiet w ciąży może świadczyć o zagrażającej życiu matki i dziecka zakrzepowej plamicy małopłytkowej (thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP) lub o zespole hemolityczno-mocznicowym (haemolytic uraemic syndrome, HUS). Wykonanie rozmazu mikroskopowego jest niezbędne w przypadkach leukocytozy lub leukopenii, a także wówczas, gdy na wyniku morfologii pojawi się "oflagowanie", czyli informacja, że wykonanie automatycznego rozdziału leukocytów nie jest możliwe, np. z powodu obecności agregatów lub aglutynatów krwinek czerwonych, hemolizy, drobnych skrzepów czy komórek o nieprawidłowej morfologii. Rozmaz mikroskopowy należy również wykonać, gdy odsetek komórek MID przekracza górny zakres wartości referencyjnej (z reguły jest to 9-11%) lub gdy podejrzewamy chorobę układu krwiotwórczego bądź limfoidalnego.

Panel badań specjalistycznych jest uzależniony od obrazu klinicznego i obejmuje ocenę cytologiczną i histologiczną szpiku (mielogram i trepanobioptat) oraz ocenę węzłów chłonnych. Dzięki diagnostom zajmującym się oceną preparatów cytologicznych możliwe jest szybkie ustalenie przynajmniej wstępnego rozpoznania, na potwierdzenie którego w badaniach molekularnych czy cytogenetycznych trzeba nieraz poczekać kilka, a nawet kilkanaście dni. Z kolei trepanobiopsja pozwala na wgląd w architektonikę szpiku, dając możliwość oceny stadium zaawansowania klinicznego choroby i stopnia nacieczenia szpiku przez komórki nowotworowe czy też rozpoznania chorób przebiegających ze zwłóknieniem lub aplazją szpiku. Tutaj nieodzowny jest udział histopatologa i współpracującego z nim diagnosty.

Dzięki szybkiemu rozwojowi biologii molekularnej i inżynierii genetycznej diagności wykonują obecnie szereg wysoce specjalistycznych badań, a ich rola staje się w ostatnich latach coraz bardziej doceniana. Trudno wyobrazić sobie współczesną hematologię bez specjalistycznych badań immunofenotypowych czy żmudnych badań cytogenetycznych lub molekularnych. Rozpoznanie większości chorób hematologicznych opiera się obecnie właśnie na wynikach takich analiz. Zarówno w procesie diagnostycznym, jak i podczas monitorowania leczenia niezwykle istotne są badania wykonywane metodą cytometrii przepływowej. Umożliwiają one rozpoznanie oraz diagnostykę różnicową chorób hematologicznych na podstawie fenotypu antygenowego, monitorowanie mierzalnej choroby resztkowej, a także ocenę klonu nowotworowego, tak istotną np. w diagnostyce nocnej napadowej hemoglobinurii czy ostrych białaczek szpikowych. Niezwykle ważna jest tutaj dobra znajomość coraz nowocześniejszych cytometrów i zasad ich kalibrowania, umiejętność właściwego bramkowania komórek i znajomość oprogramowania komputerowego umożliwiającego analizowanie otrzymanych wyników.

W badaniach cytogenetycznych oprócz tzw. cytogenetyki klasycznej olbrzymią rolę odgrywa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH) oraz hybrydyzacja genomowa. Dzięki nowoczesnemu oprogramowaniu, które zastąpiło ręczne układanie kariogramów, obecnie możliwe jest sprawniejsze, choć nadal praco- i czasochłonne, wykrywanie trudnych do uwidocznienia aberracji cytogenetycznych. Wiąże się to z koniecznością posiadania przez diagnostów-cytogenetyków dodatkowych umiejętności obsługiwania nowoczesnych programów komputerowych. W badaniach molekularnych do wykrywania produktów genów fuzyjnych powstałych w wyniku aberracji chromosomowych wykorzystywana jest już nie tylko przełomowa jeszcze kilkanaście lat temu technika RT-PCR (reverse-transcription polymeraze chain reaction - łańcuchowa reakcja polimerazy z odwrotną transkrypcją), lecz także stosowane coraz powszechniej sekwencjonowanie nowej generacji (new generation sequencing, NGS) czy badania polimorfizmu genów.

Coraz szerzej i z coraz większym powodzeniem w leczeniu nowotworów krwi wykorzystuje się przeszczepianie komórek macierzystych. W procedurę tę również zaangażowani są diagności laboratoryjni obsługujący separatory komórkowe, bankujący komórki macierzyste i przygotowujący je do przeszczepienia. Wdrażanie nowatorskiej metody leczenia, jaką stanowi terapia CART (chimeric antigen receptors T cell therapy), polegająca na genetycznym ukierunkowaniu pobranych od chorego limfocytów T na konkretny rodzaj nowotworu i okrzyknięta przyszłością światowej hematoonkologii XXI wieku, również nie byłoby możliwe bez istotnego zaangażowania diagnostów w proces przygotowywania komórek do przeszczepu.

Wykładnikami postępu, jaki się dokonał w medycynie w ciągu ostatnich kilkunastu lat jest zatem rozwijająca się dynamicznie diagnostyka laboratoryjna, obecność wykwalifikowanego diagnosty w procesie rozpoznawania chorób, ścisła współpraca diagnosty i lekarza, a także coraz nowsze i skuteczniejsze metody leczenia.

2.Pobieranie, opracowywanie i przechowywanie materiału do badań laboratoryjnych. Podstawowe przedanalityczne błędy laboratoryjne

Ewelina Ziółkowska, Aleksandra Kubiak, Iwona Urbanowicz

Pobranie materiału biologicznego, w tym krwi do badań laboratoryjnych jest najczęściej wykonywaną procedurą i kluczowym etapem w procesie diagnostyczny. Prawidłowe pobranie krwi gwarantuje dobrą jakość materiału i tym samym pozwala uniknąć niepotrzebnych błędów, np. zafałszowanych wyników badań laboratoryjnych. Czynności przedanalityczne są niezwykle ważne. Potwierdzają to dane statystyczne, w których wykazano, że błędy przedanalityczne stanowią nawet do 75% wszystkich błędów popełnianych w całym procesie opieki medycznej nad pacjentem.

2.1.Przygotowanie pacjenta do pobrania krwi

Odpowiednie przygotowanie pacjenta do pobrania krwi jest jednym z istotnych elementów pozwalających uniknąć nieprawidłowych wyników badań laboratoryjnych. Zwykle próbki krwi do badań należy pobierać rano, na czczo (8-12 godzin po ostatnim posiłku), z zachowaniem niezmienionej aktywności fizycznej pacjenta przed pobraniem, przed wdrożeniem u niego procedur diagnostyczno-terapeutycznych. Dodatkowo co najmniej na godzinę przed pobraniem krwi pacjent nie powinien palić papierosów i na dzień przed pobraniem nie powinien spożywać alkoholu. Konieczne jest udokumentowanie dokładnego czasu pobrania materiału na skierowaniu do laboratorium.

2.2.Technika pobierania krwi z żyły w dole łokciowym - pacjent dorosły

Krew pobiera wykwalifikowany i przeszkolony w tym celu personel medyczny, najczęściej pielęgniarki. Przed pobraniem krwi konieczne jest odpowiednie przygotowanie miejsca z poszanowaniem komfortu i prywatności pacjenta. Blaty robocze oraz podłokietniki siedzisk przeznaczonych do pobierania krwi muszą być zdezynfekowane, aby usunąć ryzyko zanieczyszczenia patogenami środowiska. Osoba pobierająca krew do badań, po uprzednim umyciu i dezynfekcji dłoni, powinna założyć dobrze dopasowane jednorazowe rękawiczki ochronne, a po wykonaniu czynności pobrania krwi ponownie przeprowadzić higienę rąk. Dla zachowania maksymalnego bezpieczeństwa pacjenta oraz zgodnie z zasadami dobrej praktyki laboratoryjnej do pobrania krwi wykorzystywany jest sprzęt jednorazowego użytku: jałowe gaziki, sterylne igły, probówki lub probówko-strzykawki.

Etapy prawidłowego pobrania krwi są następujące:

1. Przygotowanie miejsca i zapewnienie niezbędnego wyposażenia

Sprzęt potrzebny do pobrania krwi powinien się znajdować w bezpiecznym i łatwo dostępnym miejscu dla osoby wykonującej zabieg; są to:

- jednorazowe rękawiczki;

- rekomendowane probówki z aktualną datą ważności;

- opaska uciskowa;

- alkoholowy środek do dezynfekcji;

- gaziki nasączone 70% alkoholem do dezynfekcji skóry;

- gaza lub wacik do nałożenia na miejsce po wkłuciu;

- etykiety próbek laboratoryjnych;

- długopis lub mazak do opisania próbek;

- niezbędna dokumentacja;

- szczelne torby i pojemniki transportowe;

- worki i odporne na przebicie pojemniki na odpady medyczne.

2. Identyfikacja pacjenta (aktualny dokument tożsamości), sprawdzenie poprawności danych na skierowaniu.

3. Przygotowanie, opisanie i/lub oklejenie kodami kreskowymi niezbędnych probówek.

4. Omówienie procedury pobrania materiału i uzyskanie ustnej zgody pacjenta. Należy pamiętać, że pacjent ma prawo do odmowy wykonania zabiegu w dowolnym momencie, dlatego należy się upewnić, że dobrze zrozumiał procedurę.

5. Wybór odpowiedniego miejsca wkłucia. U osób dorosłych jest to najczęściej żyła w dole łokciowym lub na przedramieniu. Żyła powinna być odpowiedniej wielkości i dobrze wyeksponowana bez zakładania opaski uciskowej.

6. Higieniczne mycie i odkażenie rąk personelu pobierającego, założenie rękawiczek jednorazowych.

7. Dezynfekcja miejsca wkłucia. Wybrane miejsce należy przetrzeć jałowym gazikiem nasączonym 70% alkoholem przez 30 sekund i pozostawić do całkowitego odparowania (nie wycierać).

8. Pobranie krwi. Należy założyć opaskę uciskową na wysokości 4-5 cm powyżej miejsca wkłucia i ponownie zbadać żyłę, a następnie przytrzymać ją, umieszczając kciuk poniżej miejsca wkłucia. Szybkim i pewnym ruchem wprowadzić igłę pod kątem 30° lub mniejszym do naczynia i kontynuować wprowadzanie igły wzdłuż żyły pod tym samym kątem. Zwolnić opaskę uciskową. Po pobraniu wystarczającej ilości krwi należy ostrożnie usunąć igłę i ucisnąć miejsce po wkłuciu za pomocą jałowego gazika. Ponadto powinno się poprosić pacjenta o kontynuowanie ucisku miejsca po wkłuciu poprzez przytrzymanie opatrunku oraz poinstruować, aby jego ramię pozostało wyprostowane i podniesione powyżej poziomu serca. Ważne jest, aby pacjent nie zginał ręki ze względu na możliwość powstania krwiaka podskórnego.

9. Dezynfekcja stanowiska pracy, rąk personelu i uzupełnienie dokumentacji medycznej.

10. Odpowiednie przygotowanie i zabezpieczenie próbek do transportu. Pobranie krwi można wykonać zamkniętym systemem aspiracyjno-próżniowym lub próżniowym (dawniej stosowano system otwarty). Zamknięty system do pobierania krwi jest bezpieczny dla pacjenta i osoby pobierającej. Kontakt z krwią pacjenta jest ograniczony do minimum, a praca przy jego użyciu wygodna i szybka. Probówki próżniowe są sterylne, mają kalibrowaną próżnię i szeroką gamę odczynników w zależności od badania, na które ma być pobrana krew. Ponadto zaopatrzone są w międzynarodowy kod barwny w celu szybkiej identyfikacji probówek (kolorowe oznaczenia odpowiadają międzynarodowym standardom ISO 6710) i wyposażone w ergonomiczne zamknięcie. Co więcej, gumowe elementy korka są wykonane ze specjalnego tworzywa, zapobiegającego przyleganiu krwi do zamknięcia. W systemie zamkniętym z wykorzystaniem probówek próżniowych (z wytworzoną komercyjnie wewnątrz probówek próżnią) krew automatycznie spływa do probówki, gdy tylko igła znajdzie się w żyle pacjenta. Istnieją też probówki aspiracyjno-próżniowe, w których próżnię wytwarza się samodzielnie poprzez pociągnięcie tłoka, a następnie tak przygotowaną probówkę podłącza do igły umiejscowionej wcześniej w żyle pacjenta. Natomiast system otwarty to pobranie polegające na aspiracji krwi z żyły za pomocą strzykawki, poprzez pociąganie za jej tłok.

2.3.Rodzaje materiału do badań morfologicznych (krew żylna, włośniczkowa, różnice między nimi)

Do rutynowych badań laboratoryjnych najczęściej wykorzystywana jest krew żylna, gdyż stanowi dobry wskaźnik stanu fizjologicznego całego organizmu. Jest też stosunkowo łatwa do pozyskania (tab. 2.1). Pobieranie i badanie krwi włośniczkowej jest preferowane u noworodków, niemowląt i małych dzieci, co wynika z utrudnionego dostępu do odpowiednich żył i zmniejszonej objętości krwi u małego pacjenta. Zabieg pobrania krwi włośniczkowej jest uznawany za łatwiejszy i mniej bolesny niż tradycyjne nakłucie żyły łokciowej.

TABELA 2.1.

Zalety i wady pobierania krwi żylnej do badań laboratoryjnych

Zalety

Wady

- Możliwość szybszego uzyskania materiału do badań w porównaniu z pobraniem krwi włośniczkowej

- Zwiększony potencjał powstawania podbiegnięć krwawych (tzw. krwiaków) u pacjenta

- Mniejsze prawdopodobieństwo domieszki płynu tkankowego

- Konieczny bardziej stabilny ogólny stan pacjenta niż przy pobieraniu krwi włośniczkowej

- Mniejsze ryzyko hemolizy

- Możliwość wywołania niedokrwistości jatrogennej przez wielokrotne pobieranie większej ilości krwi

W celu pobrania krwi włośniczkowej należy:

- zdezynfekować i ogrzać miejsce nakłucia (palec u ręki, palec u nogi, pięta lub ucho);

- nakłuć wybrane miejsce znormalizowanym nożykiem na głębokość 3-5 mm;

- pierwszą kroplę krwi zetrzeć suchym jałowym gazikiem, a następnie pobrać materiał do badania do odpowiedniej kapilary.

Krew powinna swobodnie wypływać (nie należy jej wyciskać). Nie należy pobierać krwi z naczyń włosowatych u dorosłych pacjentów, jeżeli dostępne są odpowiednie żyły i pacjent wyraża zgodę na ich nakłucie. W szczególności nie powinno się stosować tej metody pobrania krwi w sytuacji, gdy pacjent jest odwodniony albo występują u niego obrzęki obwodowe lub zaburzenia ukrwienia kończyn. Dodatkowo ryzyko hemolizy w próbce krwi włośniczkowej jest większe niż w próbce krwi żylnej.

W dotychczas przeprowadzonych badaniach naukowych porównujących rozbieżności w parametrach hematologicznych między krwią włośniczkową i żylną odnotowano pewne niewielkie różnice. We krwi włośniczkowej liczba erytrocytów i stężenie hemoglobiny są nieco większe niż we krwi żylnej, podobnie liczba leukocytów jest nieznacznie zwiększona (średnio o 8%), a liczba płytek krwi nieznacznie obniżona (średnio o 9%) w porównaniu z parametrami hematologicznymi oznaczonymi we krwi żylnej.

2.4.Antykoagulanty

Nie ma uniwersalnego antykoagulantu zalecanego do wszystkich badań krwi. Najczęściej stosowanymi antykoagulantami w badaniach hematologicznych są:

- sole kwasu etylenodiaminotetraoctowego (K2EDTA, K3EDTA lub Na2EDTA), rekomendowane do wykonywania badania morfologii czy badań molekularnych;

- heparyna litowa lub sodowa powszechnie stosowana w badaniach cytogenetycznych, biochemicznych i niekiedy w badaniach molekularnych;

- cytrynian sodu, wykorzystywany przede wszystkim do badań układu krzepnięcia i weryfikacji liczby płytek krwi w przypadku podejrzenia trombocytopenii EDTA-zależnej.

Bez względu na rodzaj antykoagulantu czy dodatku innej substancji chemicznej w probówce należy zawsze sprawdzić datę ważności probówki przed pobraniem krwi. Użycie przeterminowanych probówek może bowiem prowadzić do otrzymania nieprawidłowych wyników. Ponadto w celu uzyskania rzetelnych wyników badań laboratoryjnych bardzo ważne jest zachowanie odpowiedniego stosunku między objętością pobranej krwi i antykoagulantu użytego w probówce, jak również prawidłowe wymieszanie próbówki z krwią bezpośrednio po jej pobraniu.

K2EDTA

Antykoagulantem rekomendowanym przez Międzynarodowy Komitet Standaryzacji w Hematologii (International Committee for Standardization in Hematology, ICHS) do oceny morfologii krwi jest wersenian dwupotasowy kwasu etylenodiaminotetraoctowego - K2EDTA - w stężeniu 1,5 ? 0,25 mg/ml, który poprzez wiązanie jonów Ca2+ zapobiega krzepnięciu krwi. Podstawowe parametry morfologiczne zachowują stabilność do 24 godzin od momentu pobrania. Rozmaz krwi należy jednak wykonać do 6 godzin, gdyż struktury wewnętrzne leukocytów ulegają naturalnej degradacji już kilka godzin po pobraniu krwi.

Obecność K2EDTA nie wpływa na barwienie preparatów metodą Maya-Grünwalda-Giemsy. Należy mieć też na uwadze, że w obecności K2EDTA może dochodzić do zmiany kształtu płytek krwi, średniej objętości płytek (mean platelet volume, MPV). Można również zaobserwować zjawisko pseudotrombocytopenii EDTA-zależnej, czyli tzw. małopłytkowości rzekomej, wynikającej z powstawania agregatów płytkowych tworzących się pod wpływem kontaktu z K2EDTA. W przypadku podejrzenia pseudotrombocytopenii krew należy pobrać do probówki z dodatkiem innego antykoagulantu (zwykle jest nim 3,8% cytrynianu sodu, który nie aktywuje przeciwciał znajdujących się na płytkach i nie powoduje ich zlepiania) lub na specjalnie "dedykowane" probówki z jonami Mg2+.

Heparyna

W diagnostyce hematologicznej probówki z heparyną litową lub sodową w stężeniu 20-50 j.m./ml są najczęściej wykorzystywane do badań cytogenetycznych, a w badaniach biochemicznych - do oceny stężenia zjonizowanego wapnia i analizy osocza oraz wykonania gazometrii. Heparyna aktywuje antytrombinę, blokując kaskadę krzepnięcia, dzięki czemu otrzymujemy krew pełną/osocze do badania. Próbki krwi pobranej na heparynę nie należy stosować do wykonywania testów koagulologicznych (osocze heparynizowane może powodować tworzenie fibryny in vitro) lub rozmazów krwi obwodowej, ponieważ heparyna prowadzi do powstawania artefaktów (fioletowoniebieski odcień rozmazów krwi, dodatkowo tworzenie zlepów płytek krwi), co utrudnia prawidłową interpretację elementów morfotycznych krwi i ocenę rozmazu.

Cytrynian sodu

Cytrynian sodu w stężeniu 3,2% jest standardowym antykoagulantem zalecanym do wykonania testów krzepnięcia krwi [fibrynogen, APTT (activated partial thromboplastin time - czas częściowej tromboplastyny po aktywacji), PT (prothrombin time - czas protrombinowy), TT (thrombin time - czas trombinowy)]. Jego mechanizm działania polega na wiązaniu jonów Ca2+, Mg2+, Zn2+ oraz hamowaniu wytwarzania enzymów litycznych aktywujących kaskadę krzepnięcia. Cytrynian sodu (w stężeniu 3,8%) jest także wykorzystywany do oznaczania szybkości opadania erytrocytów, tzw. odczynu Biernackiego (OB).

Krew do badań koagulologicznych pobiera się w proporcji 9:1 (9 objętości krwi do 1 objętości antykoagulantu), natomiast do badania OB w proporcji 4:1. Stabilność próbek ocenia się maksymalnie do 3 godzin od momentu pobrania krwi.

2.5.Błędy związane z pobieraniem próbek krwi i procesem przedanalitycznym

Błędy związane z fazą przedanalityczną stanowią nawet do 75% wszystkich błędów laboratoryjnych. Do najczęstszych nieprawidłowości wynikających z nieodpowiedniego pobrania krwi należą:

- hemoliza;

- zanieczyszczenie próbek;

- agregacja płytek krwi.

Hemoliza wydaje się najczęstszym problemem, występującym zwykle na etapie przedanalitycznym. Hemolizę in vitro mogą wywołać różne czynniki, najczęstsze z nich przedstawiono w tabeli 2.2. W rekomendacjach Światowej Organizacji Zdrowia (World Health Organization, WHO) podkreśla się znaczenie zachowania właściwej kolejności pobierania krwi do odpowiednich badań laboratoryjnych (tab. 2.3).

Pobranie krwi jest procesem złożonym i na każdym etapie istnieje możliwość popełnienia błędu, który w konsekwencji może wpływać na wiarygodność wyników. Wielu z nich można jednak uniknąć przez stosowanie prawidłowej techniki pobrania krwi oraz zachowywanie należytej staranności i czujności na każdym etapie.

Tabela 2.2.

Czynniki zwiększające ryzyko hemolizy w próbce

Przykładowe czynniki zwiększające ryzyko hemolizy w próbce

- Nieodparowanie alkoholu lub środka dezynfekującego ze skóry pacjenta przed pobieraniem krwi (za szybko wykonane wkłucie)

- Użycie igły o zbyt małej lub zbyt dużej średnicy w stosunku do naczynia krwionośnego, z którego pobierana jest krew

- Niezachowanie właściwej proporcji między antykoagulantem a ilością pobranej krwi (niewłaściwa objętość krwi w probówce)

- Używanie probówki o nieadekwatnej do wymagań objętości, co wiąże się z wytworzeniem zbyt dużej próżni (np. użycie zbyt dużej probówki dla pacjenta pediatrycznego)

- Zbyt energiczne mieszanie probówki

- Nieprawidłowe warunki transportu i przechowywania

Tabela 2.3.

Kolejność pobierania krwi do badań laboratoryjnych

Zalecana kolejność pobierania próbek krwi do badań laboratoryjnych

1. Probówka na badania bakteriologiczne (posiewy krwi); ewentualnie próbka natywna

2. Probówka do badań koagulologicznych (zawsze jako druga; przy czym, jeśli próbka bakteriologiczna nie jest pobierana, jako pierwszą należy pobrać próbkę bez antykoagulantu)

3. Probówka z aktywatorem krzepnięcia lub żelem separującym do badań biochemicznych, immunologicznych i serologicznych

4. Probówka z heparyną litową do badań cytogenetycznych lub gazometrii

5. Probówka EDTA do badań hematologicznych lub molekularnych

6. Probówka z ACD, ACDA lub ACDB do badań HLA, DNA, w tym testów na ojcostwo

7. Probówka z fluorkiem sodu do badania stężenia glukozy

9. Probówka do badania odczynu Biernackiego (OB)

ACD (acid citrate dextrose) - kwaśny cytrynian dekstrozy; ACDA (acid citrate dextrose solution A) - kwaśny cytrynian dekstrozy z roztworem A; ACDB (acid citrate dextrose solution B) - kwaśny cytrynian dekstrozy z roztworem B; EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) - kwas wersenowy; HLA (human leukocyte antigens) - ludzkie antygeny leukocytarne.

2.6.Transport, opracowanie i przechowywanie próbek

Niewłaściwe warunki transportu czy przechowywania materiału pobranego do badań mogą się przyczynić do otrzymania błędnych wyników i/lub spowodować, że próbka nie będzie się nadawała do testów. Próbki krwi należy transportować w specjalnych pojemnikach, zapewniających odpowiednią temperaturę i optymalny czas. Bardzo ważne jest, aby nie dopuszczać do przekroczenia optymalnego czasu od pobrania krwi do wykonania badania. ICSH zaleca przechowywanie próbek krwi w temperaturze 4°C.

Do błędów na etapie opracowywania materiału do badań można zaliczyć:

- niewłaściwe zabezpieczenie próbek, przyczyniające się do utraty części osocza/surowicy na skutek parowania;

- nieodpowiednie warunki wirowania;

- zbyt późne oddzielenie surowicy lub osocza od elementów morfotycznych.

2.7.Podsumowanie

W podrozdziale przedstawiono najistotniejsze informacje dotyczące pobierania, opracowywania i przechowywania krwi do badań oraz podstawowe błędy w obszarze przedanalitycznym. Warto wspomnieć, że stabilność parametrów hematologicznych zależy również od rodzaju badania, metodyki, technologii analizatorów hematologicznych oraz od odczynników wykorzystanych do badań. Dlatego zaleca się przestrzeganie instrukcji producenta aparatów i/lub odczynników.

Wszystkie zamieszczone tu uwagi i zalecenia składają się na tzw. zasady dobrej praktyki laboratoryjnej, których przestrzeganie przyczynia się do eliminacji błędów i przekłada na otrzymywanie rzetelnych i wiarygodnych wyników badań laboratoryjnych.

PIŚMIENNICTWO

1. Abdollahi A., Saffar H., Saffar H.: Types and frequency of errors during different phases of testing at a clinical medical laboratory of a teaching hospital in Tehran, Iran. N. Am. J. Med. Sci. 2014, 6(5): 224-228.

2. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2010): GP44 - A4: Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens for Common Laboratory Tests; Approved Guideline - Fourth Edition.

3. Giavarina D., Lippi G.: Blood venous sample collection: Recommendations overview and a checklist to improve quality. Clin. Biochem. 2017, 50(10-11): 568-573.

4. Harr K.E.: Sample collection. Vet. Clin. N. Am. Exot. Anim. Pract. 2018, 21(3): 579-592.

5. Krabbe J., Beilmann V., Alamzad-Krabbe H. i wsp.: Blood collection technique, anticoagulants and storing temperature have minor effects on the isolation of polymorphonuclear neutrophils. Sci. Rep. 2020, 10(1): 14646.

6. Méndez A., Bargetzi M., Huber A. i wsp.: Präanalytik in der Hämatologie - Fallen und Tücken. Ther. Umsch. 2013, 70(8): 449-455.

7. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. World Health Organization, Geneva 2010.

8. Zini G.; International Council for Standardization in Haematology (ICSH): Stability of complete blood count parameters with storage: Toward defined specifications for different diagnostic applications. Int. J. Lab. Hematol. 2014, 36(2): 111-113.

9. Zini G., d'Onofrio G., Briggs C. i wsp.; International Council for Standardization in Haematology (ICSH): ICSH recommendations for identification, diagnostic value, and quantitation of schistocytes. Int. J. Lab. Hematol. 2012, 34(2): 107-116.