Projekt okładki i stron tytułowych Kamil Bober

Ilustracja na okładce Kamil Bober

Wydawca Katarzyna Włodarczyk-Gil

Redakcja Urszula Pawłowska

Korekta Mieczysława Kompanowska

Koordynator ds. redakcji Renata Ziółkowska

Koordynator produkcji Adam Krajewski

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwo Naukowe PWN S.A.: Michał Latusek

Niniejsza publikacja została dofinansowana ze środków Wydziału Chemii w ramach Programu Strategicznego Inicjatywa Doskonałości na Uniwersytecie Jagiellońskim.

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw, jakie im przysługują. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim lub osobiście znanym. Ale nie publikuj jej w internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło. A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty.

Szanujmy cudzą własność i prawo

Więcej na www.legalnakultura.pl

Polska Izba Książki

Copyright ? by Wydawnictwo Naukowe PWN SA

Warszawa 2024

ISBN: 978-83-01-23533-8

DOI: https://doi.org/10.53271/2024.007

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2024 r. (Wydanie I)

Warszawa 2024

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321, faks 22 69 54 288

infolinia 801 33 33 88

e-mail: [email protected]; [email protected]

www.pwn.pl

Indeks skrótów

Skrót

Język polski

Język angielski

Skrót

Język polski

Język angielski

Ami

amitryptylina

amitriptyline

ASV

anodowa woltamperometria stripingowa

Anodic Stripping Voltammetry

ATR

spektrometria osłabionego całkowitego odbicia w podczerwieni

Attenuated Total Reflectance spectrometry

CE

elektroforeza kapilarna

Capillary Electrophoresis

C-HPSAM

chemiczna metoda dodatków wzorca punktu H

Chemical H-point Standard Addition Method

CRM

certyfikowany materiał odniesienia

certified reference material

DET

detektor, układ pomiarowy

detector

DM

metoda rozcieńczeń

dilution method

Dox

doksepina

doxepin

E

błąd

error

EDM

ekstrapolacyjna metoda rozcieńczeń

Extrapolative Dilution Method

EDX

spektrometria rentgenowska z dyspersją energii

Energy Dispersive X-ray spectrometry

EIM

ekstrapolacyjna metoda pośrednia

Extrapolative Indirect Method

EISM

ekstrapolacyjna metoda wzorca wewnętrznego

Extrapolative Internal Standard Method

ELISA

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

EOF

przepływ elektroosmotyczny

electroosmotic flow

EP

efedryna

ephedrine

EPMA

mikroanaliza rentgenowska z sondą elektronową

Electron Micro-Probe Analysis

ESM

metoda wzorca zewnętrznego

External Standard Method

FAAS

płomieniowa atomowa spektrometria absorpcyjna

Flame Atomic Absorption Spectrometry

FAES

płomieniowa atomowa spektrometria emisyjna

Flame Atomic Emission Spectrometry

FIA

wstrzykowa analiza przepływowa

Flow Injection Analysis

FTIR

spektrometria w podczerwieni z transformacją Fouriera

Fourier Transform Infrared spectroscopy

GAC

zielona chemia analityczna

Green Analytical Chemistry

GC

chromatografia gazowa

Gas Chromatography

GCS

uogólniona strategia kalibracyjna

Generalized Calibration Strategy

GFAAS

spektrometria absorpcji atomowej z piecem grafitowym

Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry

G-HPSAM

uogólniona metoda dodatków wzorca punktu H

Generalized H-point Standard Addition Method

GRCM

metoda stosunków gradientowych

Gradient Ratio Calibration Method

GRSAM

metoda dodatków wzorca stosunków gradientowych

Gradient Ratio Standard Addition Method

GSSAM

skaningowa gradientowa metoda dodatków wzorca

Gradient Scanning Standard Addition Method

HG-AAS

atomowa spektrometria absorpcyjna z generacją wodorków

Hydride Generation Atomic Absorption Spectrometry

HG-AFS

atomowa spektrometria fluorescencyjna z generacją wodorków

Hydride Generation Atomic Fluorescence Spectrometry

HPLC

wysokosprawna chromatografia cieczowa

High-Performance Liquid Chromatography

HPSAM

metoda dodatków wzorca punktu H

H-point Standard Addition Method

HSA

albumina surowicy ludzkiej

human serum albumin

ICM

zintegrowana metoda kalibracyjna

Integrated Calibration Method

ICP

spektrometria z plazmą indukcyjnie wzbudzoną

Inductively Coupled Plasma spectrometry

IDMS

spektrometria mas z rozcieńczeniem izotopowym

Isotope Dilution Mass Spectrometry

IM

metoda pośrednia

Indirect Method

IPD

pośrednia detekcja fotometryczna

indirect photometric detection

IR

spektrometria w podczerwieni

Infrared Spectroscopy

IS

wzorzec wewnętrzny

internal standard

ISAM

interpolacyjna metoda dodatków wzorca

Interpolative Standard Addition Method

ISM

metoda wzorca wewnętrznego

Internal Standard Method

IUPAC

Międzynarodowa Unia Chemii Czystej i Stosowanej

International Union of Pure and Applied Chemistry

LIBS

spektroskopia emisyjna ze wzbudzeniem laserowym

Laser-Induced Breakdown Spectroscopy

LOQ

granica oznaczalności

limit of quantification

MA

metyloamina

methylamine

MDMA

3,4-metylenodioksy-metamfetamina

3,4-methylenedioxy-methamphetamine

MEP

mefedron

mephedrone

MF/UV

mikroskopia fluorescencyjna z filtrem UV

fluorescence microscopy with UV filter

MP/P

mikroskopia polaryzacyjna w świetle przechodzącym

polarising microscopy in transmitted light

MP/S

mikroskopia polaryzacyjna w świetle spolaryzowanym

polarising microscopy in polarised light

MS

spektrometria mas

Mass Spectrometry

MS/O

mikroskopia stereoskopowa w świetle odbitym

stereoscopic microscopy in reflected light

MSN-IR

metoda odejmowania i normalizacji widm w podczerwieni

method of subtraction and normalization of IR spectra

NMR

magnetyczny rezonans jądrowy

Nuclear Magnetic Resonance

Nord

nordoksepina

nordoxepin

Nort

nortryptylina

nortriptyline

OES

optyczna spektrometria emisyjna

Optical Emission Spectroscopy

OIML

Międzynarodowa Organizacja Metrologii Prawnej

International Organization of Legal Metrology

PCA

analiza podstawowych składników

Principal Component Analysis

PEA

fenyloetyloamina

phenylethylamine

PEP

pseudoefedryna

pseudoephedrine

Py-GC

pirolityczna chromatografia gazowa

pyrolysis-gas chromatography

QC

współczynnik jakości

quality coefficient

RE

błąd względny

relative error

RSD

względne odchylenie standardowe

relative standard deviation

RV

współczynnik odzysku

recovery coefficient

SADM

metoda dodatków i kolejnych rozcieńczeń wzorca

Standard Addition and Successive Dilution Method

SAIDM

metoda dodatków wzorca i rozcieńczenia indykatywnego

Standard Addition and Indicative Dilution Method

SAM

metoda dodatków wzorca

Standard Addition Method

SD

odchylenie standardowe

standard deviation

SDA

analiza rozcieńczenia wzorca

Standard Dilution Analysis

SEM

skaningowa mikroskopia elektronowa

Scanning Electron Microscope

Simple-IDA

prosta analiza rozcieńczenia izotopowego

Simple Isotope Dilution Analysis

SPME

mikroekstrakcja do fazy stałej

Solid-Phase Microextraction

SRM

zastępcza metoda odzysku

Surrogate Recovery Method

SSA-IDA

super-równoważna analiza rozcieńczenia izotopowego

Sub- Superequivalence Isotope Dilution Analysis

St-SAM

metoda dodawania próbki do wzorca

Sample-to-Standard Additions Method

Subst-IDA

stechiometryczna analiza rozcieńczenia izotopowego

Substoichiometric Isotope Dilution Analysis

TCNQ

7,7,8,8-tetracyanochinodimetan

7,7,8,8-tetracyanoquinodimethane

TF

transferyna

transferrin

TMA

trimetyloamina

trimethylamine

TMAH

wodorotlenek tetrametyloamoniowy

tetramethylammonium hydroxide

UV/VIS

promieniowanie ultrafioletowe/widzialne

ultraviolet/visible radiation

WAC

biała chemia analityczna

White Analytical Chemistry

WCM

biała metoda kalibracyjna

White Calibration Method

WWA

wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne

polycyclic aromatic hydrocarbons

XRD

dyfrakcja rentgenowska

X-ray Diffraction

XRF

fluorescencyjna spektrometria rentgenowska

X-ray Fluorescence spectrometry

1Wstęp

Jedną z najbardziej i najszybciej rozwijających się w ostatnich latach dyscyplin chemicznych jest bez wątpienia chemia analityczna. Taki stan rzeczy można tłumaczyć między innymi tym, że jest ona tą dziedziną nauki, w której wypracowane przez lata zasady, reguły i metody mogą być bezpośrednio, szybko i pożytecznie wykorzystywane w praktyce w postaci analiz chemicznych. Wraz z widocznym postępem zachodzącym w życiu gospodarczym i społecznym przejawiającym się między innymi coraz większą dbałością o jakość produktów i usług, rośnie znaczenie analiz chemicznych i powszechne zainteresowanie nimi. Objawia się to w takich obszarach, jak ochrona zdrowia i środowiska, produkcja zdrowej żywności, walka z przestępczością oraz wielu innych.

W tym kontekście praca chemików analityków staje się bardzo odpowiedzialnym zadaniem. Dzięki stosowaniu nowych metod i technik analitycznych, innowacyjnych materiałów chemicznych i biochemicznych, a także wyspecjalizowanej aparatury, opartej na nowoczesnych technologiach, analitycy są w stanie wnikać w materię coraz głębiej, wykrywając i oznaczając zawarte w niej składniki w coraz mniejszej ilości i w rozmaitej formie chemicznej. W żadnych okolicznościach nie zwalnia to ich jednak z obowiązku wykonywania analiz chemicznych zgodnie z zasadami i regułami chemii analitycznej, w sposób jak najbardziej prawidłowy i staranny, z pełnym wykorzystaniem swojej wiedzy, umiejętności i doświadczenia. Tylko bowiem takie podejście pozwala na uzyskanie "prawdziwych" wyników analitycznych, czyli wyników o maksymalnie dużej dokładności i precyzji, a tylko takie wyniki stwarzają możliwość dokonania właściwej interpretacji rozmaitych problemów i poszukiwania właściwych dróg ich rozwiązania.

Nie zawsze uświadamiamy sobie, jak ogromne znaczenie w naszym codziennym życiu ma analiza chemiczna i kwestia prawidłowego postępowania analitycznego. Ujawniono, na przykład, że aż 30% analiz wykonywanych w laboratoriach przemysłowych w USA jest na tyle błędnych, że wymaga powtórzenia, a koszt ponoszony z tytułu tych operacji sięga kilkunastu miliardów dolarów rocznie [1]. Od konsekwencji materialnych jeszcze ważniejsze są oczywiście skutki, jakie dla naszego zdrowia i życia niosą nieprawidłowo wykonane analizy w takich dziedzinach, jak ochrona środowiska, kryminalistyka, toksykologia, farmakologia czy medycyna. W 2012 roku stwierdzono, że od lat 70. XX w. na podstawie błędnych analiz laboratoryjnych w USA mogło dojść do skazania setek niewinnych osób w sprawach o morderstwa czy gwałty [2]. Inne dane amerykańskie wskazują, że około 50% zgonów w wyniku błędów medycznych popełnianych w USA jest związanych z niewłaściwym doborem, przygotowaniem, zastosowaniem i interpretacją procedur analitycznych [3].

Błędy popełniane w toku analiz chemicznych w dużej mierze są uwarunkowane prawidłowym postępowaniem na etapie tzw. kalibracji analitycznej. Rzecz w tym, że w swojej pracy analityk nie może dowiedzieć się o rodzaju lub ilości poszukiwanego składnika materii bez użycia instrumentu, który jednak dostarcza informacje wyłącznie w formie sygnału pomiarowego. Przetworzenie sygnału pomiarowego na rodzaj lub ilość składnika jest właśnie domeną kalibracji analitycznej. Tylko wtedy, gdy zdajemy sobie w pełni z tego sprawę, możemy obiektywnie i właściwie docenić rolę i znaczenie tego procesu wśród innych etapów postępowania analitycznego.

Jest co najmniej zastanawiające, że w tak zarysowanej sytuacji zagadnieniom kalibracji analitycznej nie poświęca się należytej uwagi zarówno w ogólnie dostępnym piśmiennictwie naukowym i popularno-naukowym, jak i w programach nauczania chemii na studiach wyższych. Książki, które powstały do tej pory na ten temat, dotyczą głównie kalibracji wieloczynnikowej, niestosowanej powszechnie w praktyce analitycznej. W podręcznikach chemii analitycznej o metodach kalibracyjnych mówi się zwykle niewiele, ograniczając się najczęściej do podstawowych, zwyczajowo przyjętych podejść i rozwiązań. Choć na przestrzeni lat pojawiło się sporo artykułów, w których można znaleźć nowe procedury kalibracyjne świadczące o postępie również na tym polu analitycznym, to jednak najczęściej doniesienia te traktowane są zwykle jako czysto akademickie i nie znajdują na ogół zastosowania w praktyce laboratoryjnej.

Z pojęciem "kalibracja" studenci chemii spotykają się już od początku nauczania. Najpierw dokonują kalibracji naczyń pomiarowych, a w późniejszym okresie poznają operację kalibracji (adjustacji) instrumentu pomiarowego, polegającą ogólnie na doprowadzeniu tego instrumentu do prawidłowego działania. Z kalibracją analityczną mają do czynienia dopiero wtedy, gdy wyjustowany przyrząd pomiarowy używają do wyznaczenia sygnału analitycznego i wykonania analizy jakościowej lub ilościowej. Nie znajdując wsparcia w podręcznikach, często nie zdają sobie jednak sprawy z roli i wagi tego procesu, a w toku nabywania wiedzy z różnych innych dyscyplin chemicznych różnica między różnymi znaczeniami tego pojęcia nawet niekiedy się zaciera.

Sytuację utrudnia fakt, że w dziedzinie kalibracji analitycznej panuje wyjątkowo duży chaos nomenklaturowy. Dotyczy on nie tylko nazewnictwa kalibracyjnego, ale też pojęcia procesu kalibracji analitycznej jako takiego. Dość powiedzieć, że trudno jasno rozpoznać i określić spójną, powszechnie obowiązującą terminologię dotyczącą tego procesu, a metody wykonywania kalibracji są nazywane w przeróżny i najczęściej niekonsekwentny sposób, np. ta sama metoda jest określana w różnych źródłach jako metoda "wzorca zewnętrznego", "krzywej kalibracyjnej", "wykresu analitycznego", "krzywej cechowania", "serii wzorców", "kalibracji bezwzględnej" itp. Taki stan rzeczy nie sprzyja celom dydaktycznym, bo przecież trudno jest rzetelnie przekazać konkretną wiedzę analityczną za pomocą języka, który nie jest ujednolicony i ogólnie przyjęty. Brak wspólnej płaszczyzny porozumiewania się jest również potencjalnym źródłem nieporozumień i dwuznaczności prowadzących do błędnego i nieprawidłowego postępowania analitycznego.

Wszystko to umocniło Autora tej książki w przekonaniu, że należy podjąć próbę poprawy tej sytuacji. Pozycja przekazywana do rąk Czytelników po raz pierwszy w krajowej literaturze w sposób niemal całościowy obejmuje problematykę kalibracji w chemii analitycznej, głównie w ujęciu jednoczynnikowym, czyli w takiej formie, w jakiej stosuje się ją powszechnie na co dzień w laboratoriach analitycznych różnego typu.

Całość powstała śladem niedawno wydanej monografii w języku angielskim [4], polska wersja zawiera jednak sporo zmian i różnic w podejściu do zagadnień kalibracyjnych, co w zamierzeniu Autora ma nadać przekazywanym treściom przede wszystkim charakter mniej naukowy, a bardziej edukacyjny. W tym celu dokonano odpowiedniej selekcji poprzedniego materiału, a także uzupełniono go o nowe elementy, istotne przede wszystkim z dydaktycznego punktu widzenia. Ponadto, zaproponowano nieco inny schemat klasyfikacyjny metod kalibracyjnych, dając tym samym wyraz możliwości zastosowania różnych kryteriów ich podziału. Autor jest przekonany, że te i inne zagadnienia kalibracyjne ulegną z biegiem lat normalizacji i wejdą do kanonu nauczania chemii analitycznej.

Należy podkreślić, że książka jest skierowana nie tylko do osób zainteresowanych ściśle zagadnieniami kalibracji analitycznej. Przez pryzmat problematyki kalibracyjnej poruszane są w niej fundamentalne zagadnienia dotyczące prawidłowego postępowania analitycznego i jakości metod analitycznych. Proces kalibracyjny jest bowiem integralną częścią tych metod i w dużej mierze stanowi nie tylko o powodzeniu każdej analizy chemicznej, ale także o wiarygodności otrzymanych wyników. Autor ma więc nadzieję, że Czytelnicy znajdą w książce odpowiedzi na różne pytania i wątpliwości zarówno o specjalistycznym, jak i o bardziej ogólnym charakterze.

Książka w zasadniczej swojej części jest zbiorem rozmaitych procedur i metod analitycznych, które - przynajmniej w obszarze analizy ilościowej - są w różnym stopniu znane i stosowane w praktyce analitycznej, ale zebrane razem dają szerszy pogląd na ich specyfikę i możliwość porównania ich użyteczności analitycznej. W takim ujęciu książka ma pełnić rolę przewodnika po rozmaitych sposobach wykonywania kalibracji, a także wykorzystania metod kalibracyjnych do rozwiązywania wybranych problemów analitycznych. Opis poszczególnych rozwiązań kalibracyjnych jest uzupełniony wieloma przykładami doświadczalnymi. Oprócz tradycyjnego, stacjonarnego postępowania kalibracyjnego przedstawione są liczne przykłady procedur kalibracyjnych realizowanych w analizie ilościowej w sposób automatyczny w trybie przepływowym.

Pomocną częścią książki mogą stać się również propozycje wykorzystania różnych podejść kalibracyjnych do opanowania źródeł błędów systematycznych potencjalnie zagrażających dobrej jakości wyniku analitycznego. Warte podkreślenia jest to, że pozwalają one na ogół na uniknięcie używania nadmiernej ilości odczynników chemicznych, które powszechnie zalecane są dla osiągnięcia tego samego celu. Przedstawione rozwiązania wychodzą w ten sposób naprzeciw idei tzw. zielonej chemii, tak mocno propagowanej w ostatnich latach i znakomicie wpisującej się w ogólną politykę dbałości o ochronę zdrowia i środowiska człowieka.

Kwestie praktyczne zostały przedstawione na tle ujednoliconego, spójnego obrazu teoretycznych podstaw kalibracji analitycznej [5]. Za punkt wyjścia przyjęto jedną z definicji tego procesu [6], którą rozszerzono, nadając jej bardziej użyteczny charakter. W tym celu wprowadzono pojęcia funkcji prawdziwej, rzeczywistej i modelowej obrazujące przemianę próbki zachodzącą w toku postępowania analitycznego i logiczną konieczność użycia wzorca jako podstawy procesu kalibracyjnego. Teoretyczny obraz kalibracji połączono z zagadnieniami błędów analitycznych, wprowadzając pojęcie i klasyfikację niekontrolowanych efektów analitycznych, a także przedstawiając znaczenie eliminacji i kompensacji tych efektów z kalibracyjnego punktu widzenia.

Rozważania teoretyczne doprowadziły Autora do głównej tezy będącej koncepcyjną osią całego opracowania, według której wszystkie metody analityczne, zarówno w analizie jakościowej, jak i ilościowej, wymagają kalibracji analitycznej. Inaczej mówiąc: żadne postępowanie prowadzące do identyfikacji lub oznaczenia składnika analizowanego materiału nie może się odbyć bez tego procesu. Konsekwentnie, wprowadzono rozszerzone pojęcie wzorca kalibracyjnego, uwzględniające występowanie - oprócz wzorców chemicznych - także wzorców matematycznych, biologicznego i fizycznego. Zdając sobie sprawę z tego, że są to tezy nowe i trudne do powszechnego zaakceptowania, Autor dowodzi je na przykładach doświadczalnych ze szczególnym uwzględnieniem tych metod analitycznych, które powszechnie są uważane za niewymagające kalibracji i wzorcowania (np. analizy wagowej, analizy miareczkowej czy kulometrii).

Oddzielną część książki poświęcono problematyce kalibracji w analizie jakościowej. Trzeba powiedzieć, że o ile konieczność wykonywania kalibracji w analizie ilościowej jest oczywista w szeroko rozumianym środowisku analitycznym, o tyle przeniesienie tych zagadnień do analizy identyfikacyjnej ciągle jest pewnym zaskoczeniem i budzi wątpliwości. Trudno się temu dziwić w sytuacji, gdy żaden podręcznik chemii analitycznej o kalibracji na tym polu nie wspomina, a w czasopismach fachowych kwestia ta jest przypominana i poruszana jedynie sporadycznie. Jest to dość zaskakujące, biorąc choćby pod uwagę, że przecież ogólnie dostępna definicja kalibracji analitycznej, przyjęta w tym opracowaniu, traktuje ten proces jako dotyczący na równi analizy ilościowej i jakościowej [6].

W książce szczególną uwagę zwrócono na zagadnienia wzorcowania w analizie jakościowej, co niejako stało się odzewem na uwagi wyrażone już wiele lat temu przez Valcárcela i wsp. [7]: "Identyfikacja powiązana z analizami jakościowymi opiera się na wzorcach używanych ... do kalibracji metod"[1]. I dalej: "Opracowanie wzorców ... i ich właściwego użycia ... jest w analizie jakościowej celem, którego znaczenie nigdy dotąd nie było systematycznie rozpatrywane". Przedstawiony w książce całościowy i spójny podział identyfikacyjnych metod kalibracyjnych oparty na procesie wzorcowania [8] ma z pewnością pionierski charakter, a jednocześnie jest potwierdzeniem słuszności powyższych spostrzeżeń hiszpańskich naukowców.

Co ciekawe, zaproponowana klasyfikacja metod w analizie jakościowej okazała się zgodna zarówno pod względem strukturalnym, jak i nomenklaturowym z podejściem do tych zagadnień w analizie ilościowej. W obu przypadkach starano się zachować tradycyjne, najczęściej stosowane nazewnictwo metod kalibracyjnych, wychodząc z założenia, że wprowadzenie nowych terminów (nawet bardziej spójnych i logicznych) nie spotka się z powszechną akceptacją. Niemniej jednak zwrócono uwagę, że metody te można również klasyfikować według sposobu transformacji sygnału pomiarowego na wynik analityczny [9, 10], co w większym stopniu charakteryzuje ich potencjał analityczny.

Na podstawie metodologicznej strony kalibracji analitycznej wykazano więc jeszcze raz, że oba obszary analizy chemicznej - analiza jakościowa i ilościowa - tworzą jedną, nierozerwalną całość w chemii analitycznej. Ten z pozoru oczywisty wniosek nie zawsze jest w pełni wyczuwalny i rozpoznawalny, choćby wtedy, gdy rozpatruje się krajowe programy nauczania chemii zarówno w szkołach średnich, jak i na uczelniach akademickich.

Należy zaznaczyć, że materiał przedstawiony w książce pochodzi w dużej części z prac opublikowanych w ostatnich kilkudziesięciu latach przez Autora i jego Współpracowników. W wielu fragmentach opis zagadnień związanych z kalibracją analityczną wyraża zatem ich indywidualne podejście do tej problematyki. Jako taki jest z natury rzeczy dyskusyjny, a nawet kontrowersyjny i może budzić wiele wątpliwości lub nawet spotkać się w niektórych aspektach z całkowitą negacją. Autor zdaje sobie z tego sprawę, ale traktuje tę książkę jako pierwszą próbę - przynajmniej na krajowym polu - całościowego objęcia tych zagadnień, która być może zaowocuje alternatywnymi opracowaniami ze strony innych autorów.

Jedno nie ulega wątpliwości - tematyka kalibracji analitycznej jest tak silnie związana z pracą chemików analityków i w tak istotny sposób rzutuje na jakość tej pracy, że zasługuje na znacznie większą niż dotąd uwagę i zainteresowanie. To spostrzeżenie, którego słuszność trudno podważyć, stało się główną motywacją do napisania tej książki.

Literatura

1. Hertz H.S., Are quality and productivity compatible in the analytical laboratory? Anal. Chem., 60: 75A-85A; 1988.

2. https://www.washingtonpost.com/local/crime/fbi-overstated-forensic-hair-matches-in-nearly-all-criminal-trials-for-decades/2015/04/18/39c8d8c6-e515-11e4-b510-962fcfabc310_story.html (dostępna w listopadzie 2023 r.)

3. McPherson R.A., Pincus M.R., Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 23 ed., Elsevier, 2016.

4. Kościelniak P., Calibration in Analytical Sciences. Wiley VCH, Weinheim 2023.

5. Kościelniak P., Unified principles of univariate analytical calibration. TrAC - Trends Anal. Chem., 149: 116547, 2022.

6. Danzer K., Curie L.A., Guidelines for calibration in analytical chemistry. Part 1. Fundamentals and single component calibration. Pure Appl Chem, 70: 993-1014, 1998.

7. Valcárcel M., Cárdenas S., Gallego M., Qualitative analysis revisited. Crit. Rev. Anal. Chem., 30: 345-361, 2000.

8. Kościelniak P., Calibration methods in qualitative analysis. TrAC - Trends Anal. Chem., 150: 116587, 2022.

9. Kościelniak P., Univariate calibration techniques in flow injection analysis. Anal. Chim. Acta, 438; 323-333, 2001.

10. Kościelniak P., Wieczorek M., Univariate analytical calibration methods and procedures. A review. Anal. Chim. Acta, 944; 14-28, 2016.

2Podstawy kalibracji analitycznej

Podstawowym zadaniem chemika-analityka jest wykonywanie analiz chemicznych o charakterze jakościowym lub ilościowym. Przystępując do analizy jakościowej, należy przede wszystkim dokonać identyfikacji określonego składnika (analitu) w badanym materiale (próbce), czyli ustalić rodzaj analitu (lub analitów) obecnego w próbce lub dowiedzieć się, czy z góry określony analit jest obecny w próbce. W pewnych przypadkach interesujące mogą być też pytania: jaki jest rodzaj całej próbki, czy badana próbka jest podobna do innej próbki, czy próbka badana należy do określonej grupy próbek. W analizie ilościowej wyznacza się ilość (zawartość, stężenie) analitu w analizowanej próbce, czyli wykonuje się oznaczenie analitu.

Należy w tym miejscu zauważyć, że tak zdefiniowana praca chemika-analityka jest nie tylko wartościowa, ale na swój sposób bardzo piękna. Identyfikując lub oznaczając analit, dąży on bowiem do ustalenia stanu materii (rodzaju lub ilości analitu w analizowanym materiale) jak najbardziej zgodnego ze stanem rzeczywistym. Inaczej mówiąc, w każdym postępowaniu analitycznym w sposób bezpośredni stara się przybliżyć do "prawdy", bo przecież zgodnie z klasyczną definicją prawdy (w ujęciu Arystotelesa) "prawdziwe jest to, co jest zgodne z rzeczywistością". Autor jest przekonany, że szczypta takiego filozoficznego podejścia do codziennej, niejednokrotnie trudnej, żmudnej i prozaicznej pracy analitycznej, może wzmocnić poczucie jej dużej roli i znaczenia w naszym życiu.

Analiza chemiczna opiera się na prawach, kryteriach i metodach, z których niektóre zostały określone na długo przed powstaniem laboratoriów analitycznych, a inne stopniowo definiowano i wprowadzano do praktyki analitycznej aż do chwili obecnej. Zbiór tych reguł i zasad jest domeną chemii analitycznej jako odrębnej chemicznej dyscypliny naukowej [1]. Z jednej strony, prawidłowe wykonywanie analizy chemicznej jest uwarunkowane świadomym wykorzystaniem i wdrożeniem w życie wiedzy zaczerpniętej z chemii analitycznej. Z drugiej strony, naukowe podejście do wykonywania analiz chemicznych wzbogaca zasoby chemii analitycznej i przyczynia się do dalszego jej rozwoju. Można zatem powiedzieć, że identyfikacja i oznaczanie analitu jest pewnego rodzaju sztuką, której końcowe dzieło jest tym bardziej "piękne" i "prawdziwe", im bardziej wynika z twórczego i umiejętnego połączenia teorii i praktyki analitycznej.

Chemia analityczna jest podstawą zarówno analizy jakościowej, jak i ilościowej, dlatego oba rodzaje analizy chemicznej stanowią w zasadzie jedną całość i nawzajem się przenikają[2]. Z jednej strony, wykrycie i identyfikacja określonego składnika w próbce często jest podstawą do wyznaczenia jego ilości w tej próbce w celu uzupełnienia wiedzy o tym składniku. Z drugiej strony, określenie ilości analitu w próbce jest jednocześnie naturalnym świadectwem jego obecności w tej próbce. O jedności analizy jakościowej i ilościowej decyduje również to, że identyfikacja i oznaczanie analitu muszą odbywać się w ściśle określony sposób, czyli zgodnie z wcześniej opracowaną metodą analityczną [1] w zdefiniowanym układzie analitycznym (analit, próbka, przyrządy laboratoryjne, aparatura pomiarowa itp.). Oba rodzaje analizy chemicznej wiąże wreszcie - jak zostanie wykazane - konieczność wykonywania kalibracji analitycznej i podobna metodologia tej operacji.

Metoda analityczna obejmuje przede wszystkim odpowiednie postępowanie z próbką. Niezależnie od rodzaju analizy i szczegółowego sposobu jej wykonania na postępowanie to składają się zawsze następujące główne etapy:

- reprezentatywne pobranie próbki z jej naturalnego otoczenia lub środowiska;

- przetworzenie próbki (poprzez zmianę stanu skupienia, rozdzielenie składników, rozcieńczenie lub zatężenie, zmianę temperatury, poddanie reakcji chemicznej itd.), czyli nadanie jej postaci i właściwości fizykochemicznych najbardziej odpowiednich do wykonania pomiaru za pomocą odpowiednio wybranego analitycznego instrumentu pomiarowego[3];

- poddanie próbki pomiarowi za pomocą analitycznego instrumentu pomiarowego.

Instrument pomiarowy dostarcza informacji o składzie chemicznym badanej próbki. Można go jednak traktować jako "analityczny" tylko wtedy, gdy informacje te są różne dla różnego rodzaju analitów i dla analitu występującego w różnej ilości. Im dany instrument charakteryzuje się większym zróżnicowaniem informacji pomiarowych, tym jest bardziej wartościowy z analitycznego punktu widzenia.

Analityczne instrumenty pomiarowe działają na różnych zasadach charakterystycznych dla danej techniki pomiarowej (np. spektrometrii emisyjnej lub absorpcyjnej czy woltamperometrii). Informacje o obecności i ilości analitu w badanej próbce są przekazywane w postaci sygnałów pomiarowych, czyli funkcji wiążących dwie wielkości: jedną o charakterze dynamicznym, związanym ze zjawiskami energetycznymi typowymi dla danej techniki pomiarowej (np. transmitancja, absorbancja czy natężenie prądu), a drugą o charakterze statycznym, określającym stałe lub chwilowe warunki, w jakich sygnał jest wyzwalany (np. długość fali emitowanego lub absorbowanego promieniowania, potencjał elektrody). Sygnał określający w danym momencie rodzaj lub ilość analitu w próbce nosi nazwę sygnału analitycznego.

Obie wielkości określające sygnał pomiarowy odgrywają zasadniczą rolę w analizie chemicznej, mianowicie:

- wartość wielkości statycznej odpowiadająca maksymalnej wartości wielkości dynamicznej świadczy o rodzaju analitu w próbce,

- maksymalna wartość (intensywność) wielkości dynamicznej świadczy o ilości składnika w próbce.

Schematyczny obraz sygnału pomiarowego i jego interpretacja analityczna są przedstawione na rys. 2.1. Wynika z niego, że - obrazowo mówiąc - analit identyfikuje się na podstawie położenia, a oznacza na podstawie wysokości (intensywności) odpowiadającego mu sygnału pomiarowego. W wielu przypadkach pomiar wysokości piku zastępuje się pomiarem pola powierzchni pod nim, choć zawsze z teoretycznego punktu widzenia są to wielkości równoważne.

Rys. 2.1

Sygnał pomiarowy o położeniu Yjak i intensywności Yil świadczących odpowiednio o rodzaju i ilości składnika w próbce

Podstawowy problem analityczny polega na tym, że sygnał analityczny - niezależnie od techniki pomiarowej i sposobu pomiaru - nie jest jednoznaczną miarą rodzaju i ilości analitu w próbce, ale jedynie informacją wskazującą, że pewien składnik w pewnej ilości znajduje się w próbce. Wynika to stąd, że wartości położenia i intensywności sygnału analitycznego zależą nie tylko od rodzaju i ilości analitu, ale także od innych czynników instrumentalnych i chemicznych. Ponadto, w wielu przypadkach sygnał o określonym położeniu odpowiada nie tylko analitowi, ale także jednemu lub nawet kilku innym składnikom próbki. Analityk nie może być więc nigdy całkowicie przekonany, że sygnał o danym położeniu jest dowodem na obecność poszukiwanego analitu, a tym bardziej nie może sądzić o ilości analitu na podstawie mierzonej intensywności odpowiadającego mu sygnału.

Należy zatem podkreślić, że nawet najbardziej uważne i poprawne postępowanie z próbką nie prowadzi do zakończenia analizy chemicznej. Aby wykonać analizę, należy stworzyć możliwość transformacji sygnału analitycznego do ściśle określonego rodzaju lub ilości analitu i tę transformację wykonać. Na tym właśnie polega istota kalibracji analitycznej.

2.1. Zasada i definicja kalibracji analitycznej

Oficjalna i obecnie obowiązująca definicja kalibracji analitycznej została zaproponowana przez Międzynarodową Unię Chemii Czystej i Stosowanej (IUPAC) w 1998 r. [2]: "Kalibracja w chemii analitycznej to operacja określająca związek funkcyjny pomiędzy wartościami mierzonymi (intensywnościami sygnałów w określonych położeniach sygnału) a wielkościami analitycznymi charakteryzującymi rodzaje analitów i ich ilość (zawartość, stężenie)".

Jest oczywiste, że znając wymagany w definicji związek funkcyjny między parametrami (intensywnością i położeniem) sygnału analitycznego i wynikiem analitycznym, możemy wyznaczyć ten wynik na podstawie zmierzonych parametrów. Określenie tego związku wymagałoby jednak znajomości wyniku analitycznego, a ten przecież jest nieznany i poszukiwany w toku analizy. Mamy zatem do czynienia z pewnego rodzaju paradoksem, który w istocie przeszkadza w zrozumieniu procesu kalibracji analitycznej. W celu nadania tej definicji bardziej praktycznego znaczenia należy głębiej zastanowić się nad sensem i znaczeniem zawartego w niej pojęcia "związku funkcyjnego" [3].

Przed podjęciem jakichkolwiek czynności wchodzących w skład przygotowania próbki do pomiaru rodzaj analitu i jego ilość w próbce można określić mianem prawdziwej wartości, xt, analitu. Gdyby w tym momencie istniała możliwość wykonania pomiaru sygnału analitycznego Yt dla tego analitu, to zależność między tym sygnałem a prawdziwą wartością analitu:

Yt = T(xt)

[2.1]

można byłoby nazwać prawdziwym związkiem funkcyjnym lub krócej - funkcją prawdziwą. Wyznaczenie tego związku nie jest jednak w praktyce możliwe, ponieważ każda analiza wymaga ingerencji analityka w formie przygotowania próbki do pomiaru i wykonania pomiaru. Wykonanie choćby najprostszych i najkrócej trwających czynności analitycznych jest zawsze związane ze zmianą pierwotnego, prawdziwego stanu chemicznego próbki, dlatego analityk nigdy nie może być pewny, w jakim stopniu ta zmiana nastąpiła. Pojęcia funkcji prawdziwej i prawdziwej wartości analitu są więc w istocie rzeczy pojęciami abstrakcyjnymi i jako takie są niemożliwe do dokładnej doświadczalnej czy matematycznej weryfikacji.

Można zatem przyjąć, że w momencie zakończenia pomiaru sygnału analitycznego rodzaj i ilość analitu w analizowanej próbce przyjmują wartość rzeczywistą x0, czyli taką, jaką analityk może i powinien w rzeczywistości wyznaczyć. Zależność między sygnałem analitycznym a rodzajem lub ilością analitu w próbce opisuje więc w tym momencie funkcja rzeczywista, Y = F(x), która dla wartości rzeczywistej analitu w próbce, x0, przyjmuje wartość Y0:

Y0 = F(x0)

[2.2]

Funkcja rzeczywista jest "związkiem funkcyjnym", o którym mowa w powyższej definicji kalibracji analitycznej. Funkcja ta odnosi się do analizowanej próbki. Dokładna postać funkcji rzeczywistej jest w praktyce nieznana, ponieważ zależy ona od szeregu zwykle bardzo złożonych zjawisk i procesów, jakie doprowadziły do aktualnego stanu tej zależności w trakcie przygotowania próbki do pomiaru. W konsekwencji, choć wartość Y0 można dokładnie zmierzyć, to wyznaczenie wyniku rzeczywistego x0 za pomocą funkcji rzeczywistej jest niemożliwe. Nie można również nazwać wyniku rzeczywistego końcowym wynikiem analitycznym.

Taka sytuacja zmusza analityka do sformułowania dodatkowej funkcji modelowej, Y = G(x), której rolą jest zastąpienie funkcji rzeczywistej w poszukiwaniu wartości rzeczywistej x0. Funkcję modelową formułuje się za pomocą odpowiednio wybranego wzorca kalibracyjnego (jednego lub kilku) o znanym rodzaju lub ilości analitu.

Ogólną sytuację uwarunkowaną istnieniem trzech funkcji kalibracyjnych i ich roli w procesie kalibracji zilustrowano na rys. 2.2.

Rys. 2.2

Schemat procesu kalibracji analitycznej w chemii analitycznej oparty na istnieniu trzech zależności między sygnałem pomiarowym Y a rodzajem lub ilością analitu x; prawdziwej Y = T(x), rzeczywistej Y = F(x) i modelowej Y = G(x) (okręgi przerywany i ciągły ilustrują próbkę zawierającą odpowiednio prawdziwy xt i rzeczywisty x0 rodzaj lub ilość analitu, a punkt jest obrazem wzorca odpowiadającego znanemu rodzajowi lub ilości xx analitu)

Dzięki użyciu wzorca chemicznego postać funkcji modelowej może być dokładnie poznana. Aby mogła ona zastąpić funkcję rzeczywistą, musi stanowić jak najbardziej wierne jej odwzorowanie rozumiane w ten sposób, że muszą one być do siebie jak najbardziej podobne przynajmniej w punktach o współrzędnych [Y0, x0] i [Yx, xx,] (patrz rys. 2.2), czyli

Yx = F(xx) ~ Y0 = F(x0)

[2.3]

Jeżeli warunek ten jest spełniony, to wartość Yx ? Y0 funkcji modelowej (lub inną, odpowiednią wartość tej funkcji) można transformować do wartości xx analitu, czyli do wyniku analitycznego, stanowiącego miarę rzeczywistego rodzaju lub ilości analitu x0 w próbce:

Yx ? Y0 ? xx ? x0

[2.4]

Proces transformacji jest końcowym etapem kalibracji analitycznej i stanowi cel wykonanej analizy jakościowej lub ilościowej.

Na podstawie powyższych rozważań można więc powiedzieć, że kalibracja analityczna to operacja polegająca na odwzorowaniu rzeczywistej zależności między sygnałem analitycznym a rodzajem lub ilością analitu w próbce (funkcji rzeczywistej) za pomocą funkcji modelowej oraz na zastosowaniu tej funkcji do transformacji sygnału uzyskanego dla analitu w próbce na wynik analityczny. Tak rozszerzona definicja kalibracji analitycznej jest schematycznie zilustrowana na rys. 2.3.

Rys. 2.3

Ogólna zasada kalibracji analitycznej w analizie jakościowej i ilościowej

Należy podkreślić naturalną logikę wprowadzonej zasady kalibracji analitycznej. Wielkości takie jak "próbka", "funkcja rzeczywista" i "wynik rzeczywisty" (rodzaj lub ilość analitu) mają swoje odpowiedniki w pojęciach "wzorzec", "funkcja modelowa" i "wynik analityczny" (otrzymany rodzaj lub ilość analitu), które wiążą się z kalibracją analityczną. Pierwsze z nich są w dużej mierze nieznane dla analityka, a drugie są znane i stanowią przybliżenie tych pierwszych. Tak jak skład i właściwości próbki nigdy nie mogą być wiernie odtworzone we wzorcu, tak postać funkcji rzeczywistej nie jest możliwa do dokładnego upodobnienia za pomocą funkcji modelowej, a rzeczywisty rodzaj lub ilość analitu w próbce w momencie pomiaru sygnału analitycznego mogą być jedynie przybliżone otrzymanym wynikiem analitycznym.

2.2. Wzorzec i modelowanie kalibracyjne

Niezbędnym elementem procesu kalibracji analitycznej jest wzorzec kalibracyjny. W ogólnym ujęciu jest to czynnik materialny lub niematerialny, który pozwala na sformułowanie funkcji modelowej odwzorowującej funkcję rzeczywistą do takiego stopnia, że wynik analityczny może być otrzymany z oczekiwaną lub wymaganą zgodnością z wynikiem rzeczywistym [3]. Naczelną rolą wzorca kalibracyjnego jest więc sformułowanie odpowiedniej funkcji modelowej, czyli wykonanie modelowania funkcji rzeczywistej.

Zdecydowanie najczęściej używanym wzorcem zarówno w analizie jakościowej, jak i ilościowej jest wzorzec chemiczny. W tym opracowaniu za wzorzec chemiczny uważa się przede wszystkim materiał syntetyczny lub naturalny, zawierający składnik o przewidywanej lub poszukiwanej obecności w próbce (w analizie jakościowej) lub o znanej ilości (w analizie ilościowej). Wzorzec chemiczny może być jedno- lub wieloskładnikowy.

W szczególnych przypadkach wzorzec chemiczny może zawierać izotop (jeden lub kilka) analitu obecnego w próbce. Jeżeli analiza jakościowa dotyczy całej próbki, to wzorcem jest niekiedy inna próbka (pełniąca wtedy rolę analitu) o mniej lub bardziej znanym składzie chemicznym. W analizie jakościowej materialny wzorzec chemiczny może być też zastąpiony swoim obrazem pomiarowym o znanych lub nawet nieznanych położeniach sygnałów odpowiadających odpowiednim składnikom wzorca. W analizie ilościowej rolę wzorca chemicznego może pełnić substancja reagująca z analitem, a także tzw. certyfikowany materiał odniesienia (CRM), czyli materiał naturalny (rzadziej syntetyczny) o ustalonym składzie wyznaczonym na podstawie badań międzylaboratoryjnych [4].

Tworząc funkcję modelową przy użyciu wzorca chemicznego, czyli wykonując modelowanie chemiczne, analityk nie wnika w teoretyczne aspekty zależności sygnału analitycznego od rodzaju lub ilości analitu. Choć w pewnych przypadkach prawa i reguły leżące u podstaw tej zależności (np. prawo Lamberta-Beera, wzór Nernsta itp.) mogą być pomocne, to tego typu kalibracja jest postępowaniem uniwersalnym, w zasadzie niezależnym od wybranej techniki pomiarowej. Stąd wynika powszechność wykorzystywania wzorców chemicznych w analizie chemicznej.

Innym rodzajem modelowania stosowanym zarówno w analizie jakościowej, jak i ilościowej jest modelowanie teoretyczne oparte na wzorcach matematycznych. W tym przypadku rolę wzorców pełnią najczęściej wzory matematyczne wynikające z ustalonych praw i reguł (np. prawa Faradaya), wielkości uniwersalne (np. masa molowa, liczba atomowa) lub podstawowe stałe fizyczne (np. stała Avogadro). Wzorcami matematycznymi mogą być też pojedyncze wielkości, które są wyznaczane na podstawie podejść teoretycznych (np. obliczeń kwantowo-mechanicznych). Wzorce tego typu wynikają również często z półempirycznego opisu zjawisk i procesów fizykochemicznych charakterystycznych da określonej metody analitycznej.

Modelowanie teoretyczne stosuje się zarówno w analizie jakościowej, jak i w ilościowej. W celu uzyskania jak najbardziej dokładnych wyników wzorce matematyczne są niekiedy wspomagane wzorcami chemicznymi.

Unikatowymi wzorcami kalibracyjnymi są wzorzec fizyczny używany w analizie grawimetrycznej (ilościowej), a także wzorzec biologiczny stanowiący podstawę jakościowej analizy sensorycznej. Kalibracja oparta na modelowaniu fizycznym i biologicznym z zastosowaniem tych wzorców zostanie szerzej omówiona w dalszej części tego opracowania (rozdz. 11.2 i 11.3).

Wymienione sposoby modelowania za pomocą wzorców różnego typu w analizie jakościowej i ilościowej są zebrane na rys. 2.4.

Rys. 2.4

Różne sposoby formułowania funkcji modelowej za pomocą wzorców kalibracyjnych w celu odwzorowania funkcji rzeczywistej

Aby wzorce kalibracyjne spełniały swoją funkcję, należy stworzyć warunki sprzyjające jak najlepszemu odwzorowaniu funkcji rzeczywistej za pomocą funkcji modelowej. Wzorce wymagają zatem prawidłowego przygotowania i odpowiedniego z nimi postępowania, często takiego samego, jaki stosuje się wobec próbki. Biorąc to pod uwagę, kalibrację analityczną należy uważać za integralną część każdej metody analitycznej i realizować z równorzędną skrupulatnością, a także poświęcać jej równorzędną uwagę (np. w tekstach przepisów analitycznych) w porównaniu z innymi procesami i zabiegami laboratoryjnymi wchodzącymi w skład tej metody.

Z powyższych rozważań wynika naczelna teza stawiana w tym opracowaniu: każda metoda analityczna wymaga wykonania kalibracji analitycznej, czyli użycia wzorca (niekoniecznie chemicznego). Wynika to stąd, że żadna metoda analityczna nie jest zdolna do dostarczenia wyniku analitycznego za pomocą funkcji rzeczywistej bez sformułowania funkcji modelowej, a funkcja modelowa może być sformułowana jedynie za pomocą wzorca kalibracyjnego.

2.3. Procedura i metoda kalibracyjna

Niezależnie od rodzaju użytego wzorca i zastosowanego sposobu modelowania, proces kalibracyjny składa się zawsze z trzech etapów: odpowiedniego przygotowania próbki i wzorca (wzorców), odwzorowania funkcji rzeczywistej za pomocą odpowiednio sformułowanej funkcji modelowej i transformacji sygnału pomiarowego mierzonego dla analitu w próbce na wynik analityczny. Każde postępowanie z próbką i wzorcem składające się tych trzech etapów, prowadzące do oszacowania rodzaju lub ilości analitu w próbce, można nazwać procedurą kalibracyjną.

Zarówno w analizie jakościowej, jak i w ilościowej procedury kalibracyjne można w różny sposób kształtować i modyfikować, szczególnie na etapie przygotowania próbki i wzorca. Jeżeli określona modyfikacja nie umniejsza zdolności danej procedury do efektywnego wyznaczenia rodzaju lub ilości analitu w próbce, a przynosi dodatkowe, istotne korzyści analityczne, to takie charakterystyczne postępowanie kalibracyjne staje się wtedy metodą kalibracyjną. Można powiedzieć, że metoda kalibracyjna nie tylko stwarza metodzie analitycznej możliwość osiągnięcia wyniku analitycznego, ale także przyczynia się do zwiększenia jej potencjału analitycznego.

Procedury analityczne mogą zasadniczo różnić się od siebie na każdym z trzech etapów: przygotowania próbki i wzorca, odwzorowania funkcji rzeczywistej i transformacji sygnału pomiarowego do wyniku analitycznego. Na etapie preparatywnym przyjmuje się dwie ogólne strategie wzajemnego traktowania wzorca i próbki. Większość metod analitycznych opracowanych w analizie jakościowej i ilościowej jest oparta na strategii rozłącznej, polegającym na osobnym, często do siebie podobnym, przygotowaniu próbki i wzorca, następnie osobnym poddaniu ich pomiarom. Alternatywą jest strategia łączna, polegająca na łączeniu wzorca z próbką w trakcie procedury kalibracyjnej

Etap odwzorowania może być realizowany również na dwa różne sposoby. Jednym z nich jest upodobnienie funkcji modelowej do funkcji rzeczywistej jedynie w pojedynczym punkcie (lub w pojedynczych punktach) tych funkcji. Taką strategię stosuje się z natury rzeczy w analizie jakościowej, a spotyka się ją również w analizie ilościowej. Inna możliwość, którą stosuje się powszechnie w analizie ilościowej, polega na odwzorowaniu funkcji rzeczywistej za pomocą funkcji modelowej w określonym przedziale punktów tych funkcji.

Jeżeli funkcje kalibracyjne są upodobnione do siebie w pojedynczym punkcie, to wartość funkcji modelowej w tym punkcie jest bezpośrednio transformowana do wyniku analitycznego. Taki sposób transformacji można nazwać drogą indykatywną. Jeżeli natomiast funkcja rzeczywista jest odwzorowana w przedziale swoich wartości, to określoną wartość funkcji modelowej transformuje się do wyniku analitycznego na drodze interpolacyjnej lub ekstrapolacyjnej.

Poszczególne etapy każdej procedury kalibracyjnej są w dużym stopniu od siebie zależne, co w sposób szczegółowy jest przedstawione na rys. 2.5. Schemat ten zostanie bardziej przybliżony w dalszej części książki na podstawie analizy konkretnych procedur i metod kalibracyjnych omawianych w analizie jakościowej i ilościowej.

Rys. 2.5

Schemat związku między poszczególnymi etapami procedury kalibracyjnej

Należy podkreślić, że metody kalibracyjne można definiować i klasyfikować według różnych kryteriów odpowiadających charakterom poszczególnych etapów ich procedur. W tym opracowaniu postanowiono utrzymać tradycyjny podział metod, nawiązujący w dużej mierze do preparatywnego etapu kalibracji. Stąd zachowano takie nazwy, jak metoda wzorca zewnętrznego, metoda wzorca wewnętrznego, metoda dodatku (lub dodatków) wzorca itp. Metody te można realizować, stosując zarówno rozłączną, jak i łączną strategię traktowania próbki i wzorca. Oprócz tego zwrócono uwagę na niezależną możliwość klasyfikacji metod kalibracyjnych według sposobu transformacji sygnału pomiarowego do wyniku analitycznego, zaliczając je do metod interpolacyjnych, ekstrapolacyjnych i indykatywnych. Taka klasyfikacja jest - jak zostanie wykazane - bardziej merytoryczna i lepiej oddaje zdolności i możliwości analityczne poszczególnych metod.

2.4. Kalibracja a błędy analityczne

Każda metoda analityczna prowadzi (dzięki kalibracji) do wyznaczenia wyniku analitycznego. Analityk nie może jednak skupić swoich wysiłków jedynie na samym sposobie wykonania analizy i kalibracji, ale powinien również zadbać o to, aby otrzymany wynik analityczny był jak najbardziej wiarygodny (miarodajny). O wiarygodności wyniku analitycznego, a więc również w pewnym sensie o wiarygodności danej metody analitycznej i metody kalibracyjnej prowadzących do tego wyniku, decydują dwie jego cechy:

- dokładność, czyli stopień zgodności między wynikiem analitycznym xx a prawdziwą wartością xt analitu (gdzie poprzez wynik analityczny należy rozumieć pojedynczą wartość otrzymanego wyniku lub średnią arytmetyczną z serii wartości tego wyniku);

- precyzja, czyli stopień zgodności między serią n wartości wyniku analitycznego xx1, xx2, ..., xxn otrzymanych daną metodą analityczną w jednakowych lub podobnych warunkach doświadczalnych (w tzw. analizach równoległych),

Brak całkowitej zgodności wyników otrzymanych w analizach równoległych i brak całkowitej zgodności między wynikiem analitycznym a wynikiem prawdziwym wynikają stąd, że w trakcie analizy zawsze popełnia się błędy przypadkowe i systematyczne. Te pierwsze powodują z jednakowym prawdopodobieństwem zwiększenie lub zmniejszenie wartości wyniku analitycznego względem wyniku prawdziwego, a drugie wyrażają się ukierunkowaną zmianą tej wartości. Błędy przypadkowe rzutują jedynie na precyzję wyniku analitycznego, natomiast jego dokładność zależy zarówno od błędów przypadkowych, jak i systematycznych. Błędów przypadkowych nie można nigdy uniknąć, bo wynikają one z niedoskonałości wszystkich czynności laboratoryjnych wykonywanych przez człowieka i niedoskonałości pracy przyrządów służących do pomiaru położenia i intensywności sygnałów. Błędów systematycznych można teoretycznie uniknąć, lecz praktycznie nie jest to możliwe.

Na podstawie dotychczasowych rozważań wyłaniają się więc pewne zasadnicze stwierdzenia, które należą do podstawowych reguł analitycznych:

- prawdziwa wartość identyfikowanego lub oznaczanego analitu nigdy nie jest znana i nie może być poznana (co wynika z zawsze koniecznej ingerencji analityka do postępowania analitycznego z udziałem próbki);

- wynik analityczny nigdy nie może być w pełni precyzyjny i w pełni dokładny (ze względu na występowanie błędów przypadkowych i systematycznych);

- precyzja i dokładności wyniku analitycznego, a więc te parametry, które decydują o jego wiarygodności, nigdy nie mogą być ściśle (dokładnie) ocenione (ponieważ wartości wyniku prawdziwego i analitycznego nie są dokładnie znane).

Należy przyznać, że powyższe wnioski nie są zbyt optymistyczne i motywujące do wykonywania analiz chemicznych. Z drugiej strony jest oczywiste, że poszukiwanie rodzaju i ilości składników otaczającej nas materii jest nieodłącznym, koniecznym i niezwykle cennym czynnikiem naszego codziennego życia. Aby więc analizy (w tym kalibracja analityczna) były wykonywane w sposób jak najbardziej poprawny i satysfakcjonujący, czyli pozwalający na unikanie dużych błędów przypadkowych i systematycznych, analityk musi podejmować próby przynajmniej przybliżonej oceny wiarygodności swojej pracy.

2.4.1 Ocena precyzji i dokładności wyniku analitycznego

Wymierna ocena precyzji wyniku analitycznego wydaje się teoretycznie dość prosta. Służą do tego rozmaite wielkości, z których powszechnie stosowane są: odchylenie standardowe (SD) i względne odchylenie standardowe (RSD). Są one wyrażone następującymi wzorami:

[2.5]

- 100%

[2.6]

gdzie xxi jest i-tą wartością wyniku analitycznego otrzymanego w serii n analiz równoległych, a x?x jest średnią arytmetyczną z n wartości tego wyniku.

Warunki doświadczalne, w jakich wykonywane są oznaczenia równoległe, nie są nigdy idealnie jednakowe (stałe). W zależności od tego, jaki jest charakter tych warunków, precyzję wyników analitycznych można wyrazić za pomocą wzorów (2.5) lub (2.6) na dwa sposoby:

- powtarzalności - wtedy, gdy na rozbieżność wyników analitycznych rzutują jedynie względy całkowicie przypadkowe (tzn. analizy równoległe są wykonywane przez jednego analityka, w tym samym laboratorium, za pomocą określonego układu analitycznego, nieprzerwanie w maksymalnie krótkim czasie);

- odtwarzalności - wtedy, gdy na przypadkową rozbieżność wyników nieznacznie wpływają pewne kontrolowane i niewielkie czynniki systematyczne (np. analizy równoległe wykonuje się w obrębie kilku dni lub za pomocą celowo zmienionego układu analitycznego).

Powstaje pytanie: czy precyzję szacuje się w jednakowy sposób w analizie jakościowej i ilościowej? Odpowiedź jest oczywiście negatywna, ponieważ wyniki analityczne otrzymane w analizie jakościowej (rodzaj analitu, bx) są niewymierne, a w analizie ilościowej (stężenie lub zawartość analitu, cx) mogą być wyrażane liczbowo. O ile zatem ilościowe wyniki analityczne cx otrzymane w oznaczeniach równoległych można bezpośrednio wykorzystać do obliczenia ich powtarzalności lub odtwarzalności za pomocą wzorów (2.5) i (2.6), o tyle w analizie jakościowej do tego celu muszą być z konieczności używane wartości położenia sygnałów Y0 lub Yx otrzymanych odpowiednio dla próbki lub dla wzorca (patrz rys. 2.6).

Rys. 2.6

Obraz wyników otrzymanych w dwóch jakościowych analizach równoległych dla próbki (okręgi) i wzorców (punkty) obarczonych błędami przypadkowymi i systematycznymi; wyniki pomiarowe Y0 i Yx służą do oceny precyzji i dokładności wyników analitycznych b0 i bx

Należy zauważyć, że wartości SD i RSD wyrażające powtarzalność lub odtwarzalność wyników analitycznych należy traktować jako przybliżone, jest bowiem oczywiste, że po każdym powtórzeniu serii analiz równoległych wartości te będą odpowiednio nieco inne. Wynika to oczywiście z nieuniknionych błędów przypadkowych popełnianych w trakcie analiz.

Jeszcze bardziej niepewna od oceny precyzji wyników analitycznych jest ocena ich dokładności. Dokładność wyników jest zdefiniowana poprzez zgodność wyniku analitycznego xx i prawdziwego xt, co wyrażają wzory określające błąd bezwzględny E i błąd względny RE:

E = xx - xt

[2.7]

- 100%

[2.8]

Jest oczywiste, że wzory te są czysto teoretyczne, choćby ze względu na zawsze nieznaną wartość wyniku prawdziwego xt. Poza tym, jak wynika z poprzednich rozważań, wynik analityczny xx można jedynie porównywać z wartością rzeczywistą x0, jaką przyjmuje analit obecny w próbce po wykonaniu pomiarów sygnałów analitycznych. Obie te wartości, xt i x0, odbiegają od wyniku analitycznego z powodu błędów przypadkowych i systematycznych, czyli z natury rzeczy są mniej lub bardziej niedokładne. Jak zatem w praktyce rozwiązać problemy wyznaczania dokładności (niedokładności) w analizie jakościowej i ilościowej?

W przypadku analizy jakościowej sprawa wydaje się dość prosta: dokładność identyfikacji analitu można liczbowo oszacować, obliczając błędy E i RE za pomocą wartości położenia sygnałów Y0 i Yx otrzymanych odpowiednio dla próbki i dla wzorca (patrz rys. 2.6.) i przyjmując we wzorach (2.7) i (2.8), że xt = Y0 i xx = Yx. Konfrontując otrzymane wyniki z przypadkowym rozrzutem sygnałów pomiarowych, można na podstawie odpowiednich testów statystycznych ocenić, czy popełnione błędy mają charakter przypadkowy czy systematyczny. Wszystko to nie daje jednak jednoznacznej odpowiedzi na podstawowe pytanie o dokładność wyników w sensie niewymiernym, tzn. czy analit obecny we wzorcu jest obecny lub nieobecny w próbce.

Należy zauważyć, że wynik analizy jakościowej może się wydawać dokładny tylko wtedy, gdy analit został prawidłowo zidentyfikowany (wykryty) w próbce, a niedokładny w przeciwnym wypadku. W rzeczywistości sytuacja jest bardziej złożona. Jest oczywiste, że gdy w próbce znajduje się analit i otrzymany wynik to potwierdza, to jest on dokładny (tzw. prawdziwie pozytywny). O wyniku dokładnym można jednak powiedzieć również wtedy, gdy jest on prawdziwie negatywny, czyli gdy wynik analityczny nie potwierdza obecności analitu w próbce, i w rzeczywistości jest on w niej nieobecny. W każdym innym przypadku wynik analizy jakościowej jest niedokładny, czyli fałszywie pozytywny lub fałszywie negatywny. Wszystkie te sytuacje są przedstawione w tab. 2.1.

Tab. 2.1

Dokładność i niedokładność wyników analitycznych w analizie jakościowej

Wynik

Ocena wyniku

Dokładność wyniku

otrzymany, bx

prawdziwy, bt

+

+

prawdziwie pozytywny

dokładny

+

-

fałszywie pozytywny

niedokładny

-

+

fałszywie negatywny

niedokładny

-

-

prawdziwie negatywny

dokładny

Nie zmienia to faktu, że wynik analityczny w analizie jakościowej nigdy nie może być traktowany jako "dokładnie" dokładny lub "dokładnie" niedokładny, ponieważ błędy przypadkowe i systematyczne popełniane w trakcie analizy zawsze stwarzają niepewność takiego stanu rzeczy. Nie można zatem powiedzieć po wykonaniu analizy, że analit "na pewno" znajduje się lub nie znajduje się w próbce. Na tej samej zasadzie nie można twierdzić, że próbka i wzorzec lub dwie porównywane ze sobą próbki są "te same", lecz co najwyżej "takie same", a także, że są "z pewnością różne", lecz "prawdopodobnie różne".

W analizie jakościowej rozbieżność między wynikiem otrzymanym a rzeczywistym można zatem również ocenić poprzez nadanie jej pewnej wartości prawdopodobieństwa i taki alternatywny sposób oceny dokładności jest często w praktyce stosowany. Tego typu ocena jest oczywiście trudna i w dużej mierze subiektywna. Często analityk dokonuje jej na podstawie wyników doświadczalnych w sposób intuicyjny na podstawie swojej wiedzy i doświadczenia. Ocenę można również oprzeć na wynikach wspomnianej wcześniej analizy statystycznej. Jeżeli obraz sygnałów pomiarowych jest bardzo złożony i niejednoznaczny, to oprócz położenia sygnału bierze się pod uwagę dodatkowe parametry identyfikacyjne (co zostanie pokazane w dalszej części tego opracowania), a także stosuje się pomocniczo odpowiednie metody statystyczne i chemometryczne [5].

Ostatecznym krokiem oceny dokładności identyfikacji analitu jest zastosowanie do analizy metody referencyjnej. Jest to metoda analityczna inna od metody o badanej dokładności, czyli oparta na innych zasadach fizykochemicznych, lecz dostosowana do identyfikacji tego samego rodzaju analitu w próbce o tym samym lub podobnym składzie chemicznym. Powinna być bardzo dobrze opracowana i zweryfikowana, a w szczególności powinna charakteryzować się zdolnością do jak najbardziej dokładnej identyfikacji badanego analitu. Jeżeli wyniki identyfikacji otrzymane metodą badaną i referencyjną są jednakowe w sensie niewymiernym (patrz tab. 2.1), to metodę badaną traktuje się jako metodę o wiarygodnej dokładności.

Trudności w ocenie dokładności ilościowych wyników analitycznych wynikają głównie stąd, że funkcja rzeczywista Y = F(c) w analizie ilościowej jest nieznana. Wynik rzeczywisty x0 nie może zatem zostać wyznaczony bezpośrednio na podstawie intensywności sygnału Y0 mierzonego dla analitu w próbce (co stanowi pewną modyfikację ogólnego schematu kalibracji analitycznej przedstawionego na rys. 2.7). W takiej sytuacji przyjmuje się z konieczności, że funkcja rzeczywista Y = G(c) jest tożsama z funkcją modelową (czyli jest przez nią dokładnie odwzorowana), a intensywność Y0 jest równa wartości Yx wyznaczonej za pomocą funkcji modelowej, co jest pokazane na rys. 2.7b. Nie oznacza to jednak oczywiście, że wynik rzeczywisty c0 jest równy otrzymanemu wynikowi analitycznemu cx, ponieważ ich faktyczna zgodność (czyli dokładność) zależy od faktycznej, a nie z góry przyjętej zgodności funkcji rzeczywistej z funkcją modelową. Zadaniem analityka jest zatem doświadczalne znalezienie choćby przybliżonej wartości rzeczywistej c0 i oszacowanie za jej pomocą dokładności wyniku analitycznego cx na podstawie wzorów (2.7) i (2.8). Dla podkreślenia orientacyjnego charakteru takiego postępowania wartość rzeczywista c0 jest często nazywana wartością oczekiwaną cocz.

Rys. 2.7

Teoretyczny (A) i praktyczny (B) obraz wyników otrzymanych w dwóch ilościowych analizach równoległych (punkty) obarczonych błędami przypadkowymi i systematycznymi, wartości cx służą do oceny precyzji, a wartości cx i cocz do oceny dokładności wyników analitycznych

Do oceny dokładności wyników w analizie ilościowej można również zastosować metodę referencyjną. Powinna ona spełniać te same warunki w odniesieniu do oznaczania określonego analitu, jaką w analizie jakościowej spełnia w procesie identyfikacji analitu. Jeżeli tak jest, to wynik otrzymany tą metodą można przyjąć za wynik oczekiwany cocz i porównać jego zgodność z wynikiem cx otrzymanym metodą badaną. Dobór odpowiedniej metody referencyjnej jest jednak dość trudny, a oznaczanie analitu obiema metodami (referencyjną i badaną) jest w wielu przypadkach procesem długim i uciążliwym.

Inną możliwością jest wykorzystanie odpowiednio dobranego certyfikowanego materiału odniesienia. Jeżeli materiał ten jest podobny pod względem składu chemicznego i właściwości fizykochemicznych do tego rodzaju próbek, do którego metoda badana została dostosowana, to ilość każdego składnika tego materiału wymieniona w certyfikacie może być traktowana jako oczekiwana wartość tego składnika. Aby wynik analityczny mógł być porównany z tą wartością, należy wykonać analizę materiału odniesienia i badanej próbki w ściśle jednakowych warunkach doświadczalnych.

W ostatnich latach daje się zauważyć tendencję do coraz bardziej powszechnego stosowania tzw. zastępczej metody odzysku do oceny dokładności wyników analitycznych. Polega ona na oznaczeniu analitu w badanej próbce przed dodaniem i po dodaniu go w znanej ilości do tej próbki, a następnie na wyznaczeniu odzysku analitu z próbką na podstawie porównania wyznaczonej różnicy ilości analitu w próbce z ilością dodaną (metoda ta zostanie szerzej przedstawiona i omówiona w rozdz. 9.2 tego opracowania). Podejście to, choć znacznie prostsze i bardziej uniwersalne od sposobów wyżej opisanych, jest jednak - co zostanie wykazane - często zawodne i może być stosowane tylko w ściśle określonych warunkach analitycznych.

Z powyższych rozważań wynika, że precyzja i dokładność wyników analitycznych - zarówno w analizie jakościowej, jak i ilościowej - są możliwe do uzyskania w sposób jedynie orientacyjny. Ważna jest zatem uwaga praktyczna (dość oczywista, lecz często nieprzestrzegana): wymierne wyniki oceny precyzji i dokładności otrzymane na podstawie wzorów (2.5)-(2.8) należy traktować nie jako dokładne i zawsze obowiązujące, ale tylko jako szacunkowe (wyrażając to np. przez podawanie obliczonych wartości z "rozsądną", nie przesadnie dużą liczbą cyfr znaczących). Z drugiej strony, precyzja i dokładność są głównymi parametrami walidacyjnymi charakteryzującymi jakość metody analitycznej. Należy więc pamiętać, by wartości tych parametrów wyznaczać na nowo po dłuższym czasie stosowania danej metody oraz po jakiejkolwiek jej chemicznej lub instrumentalnej modyfikacji. W każdym przypadku analizy należy wykonywać w sposób możliwie najbardziej staranny i prawidłowy, tak aby popełnione błędy analityczne w jak najmniejszym stopniu pokrywały się z błędami szacowania wartości precyzji i dokładności otrzymanych wyników.