A3Wzrost komórki

Hodowle komórkowe: wprowadzenie

Zarówno komórki prokariotyczne, jak i eukariotyczne można utrzymywać i poddawać manipulacjom w hodowli. Hodowla komórkowa dostarcza olbrzymią liczbę identycznych komórek, które mogą być wykorzystane w rozmaitych badaniach biologicznych i biochemicznych. Takie systemy hodowli (kultur) in vitro pozwalają na badanie wzrostu komórek oraz na przeprowadzanie manipulacji genetycznych dla zrozumienia struktury i funkcji genów.

Hodowla i podział komórek prokariotycznych

Prokarionty, takie jak E. coli, mogą być hodowane w prostych pożywkach zawierających nieorganiczne sole oraz źródło energii, na przykład glukozę. W idealnych warunkach (tj. w obecności odpowiedniego źródła energii, przy temperaturze optymalnej dla wzrostu) niektóre komórki prokariotyczne mogą namnażać się w przybliżeniu co 20 minut, co oznacza, że z pojedynczej komórki może powstać w ciągu kilku godzin wiele milionów komórek.

Cykl komórkowy organizmów prokariotycznych jest stosunkowo prosty, ponieważ replikacja DNA w pojedynczym kolistym chromosomie (patrz temat A1) zachodzi nieprzerwanie w czasie wzrostu komórki. Komórka następnie dzieli się przez rozszczepienie na dwie. W procesie tym nowa błona i ściana komórkowa tworzy się pośrodku komórki, co ostatecznie dzieli komórkę rodzicielską na dwie komórki potomne.

Hodowla komórek eukariotycznych

Hodowla drożdży jest łatwa przy zastosowaniu minimalnej pożywki, jak w przypadku komórek bakteryjnych, jednak inne komórki eukariotyczne (komórki zwierząt i roślin) wymagają znacznie bardziej złożonego środowiska hodowlanego (pożywki), które zawiera oprócz soli i glukozy różne aminokwasy i witaminy, których komórki nie potrafią same wytworzyć. Pożywki hodowlane dla wzrostu komórek zwierząt zawierają także surowicę, która dostarcza różne białkowe czynniki wzrostu konieczne dla wsparcia podziału komórki.

Hodowle komórek zwierzęcych rozpoczyna się uwolnieniem do zawiesiny (np. na drodze łagodnej homogenizacji; patrz temat A5) komórek wchodzących w skład fragmentu (wycinka) tkanki. Wyodrębnione komórki hoduje się następnie w plastikowych naczyniach hodowlanych w odpowiednich warunkach w obecności określonej pożywki do wzrostu. Hodowle przygotowane bezpośrednio z tkanek organizmu są określane jako pierwotne hodowle komórkowe. Takie hodowle można zwykle prowadzić do uzyskania 50-100 podwojeń populacji, po czym ich wzrost ustaje, a komórki umierają. Z kolei komórki pochodzące z guzów nowotworowych lub embrionalne komórki macierzyste w hodowli często dzielą się nieskończoną liczbę razy i dlatego są określane mianem stałych lub unieśmiertelnionych linii komórkowych. W odpowiednich warunkach, liczne hodowane komórki zachowują zróżnicowane właściwości odpowiednie dla ich pochodzenia. Na przykład fibroblasty mogą kontynuować wydzielanie kolagenu, a komórki nerwowe wydłużać swe aksony. Komórki macierzyste, często pobierane do hodowli z wczesnych stadiów zarodkowych, utrzymują swą zdolność do różnicowania się we wszystkie typy komórek dorosłego organizmu.

Cykl komórkowy organizmów eukariotycznych

Podziały komórek eukariotycznych muszą być starannie regulowane, a zarówno wzrost komórek, jak i replikacja DNA - precyzyjnie koordynowane dla zapewnienia powstania komórek potomnych zawierających kompletny zestaw nienaruszonych chromosomów (tzn. kompletny genom; patrz temat F2). Życie komórki eukariotycznej można zdefiniować jako cykl komórkowy, który składa się z czterech skoordynowanych procesów: wzrostu komórki, replikacji DNA, rozdziału podwojonych chromosomów do komórek potomnych, podziału cytoplazmy.

Mitoza (podział jądra komórkowego), w trakcie której rozdzielane są potomne (podwojone) chromosomy, i cytokineza (podział cytoplazmy), składające się na podział komórki, zachodzą w fazie M, która trwa tylko około jednej godziny (rys. 1). Pozostałą część cyklu komórkowego (w przybliżeniu 95%) zajmuje interfaza (rys. 1), okres między podziałami komórki. W czasie interfazy chromosomy ule-gają dekondensacji i są rozmieszczane na obszarze całego jądra komórkowego; na poziomie molekularnym jest to czas, w którym dochodzi do wzrostu komórki i replikacji DNA.

Po mitozie ma miejsce faza G1 (G od ang. słowa gap = przerwa) (rys. 1). Jest to okres pomiędzy podziałem komórki (fazą M) a rozpoczęciem replikacji DNA, w trakcie którego komórka nieprzerwanie powiększa się. Następnie komórka wchodzi w fazę S (ang. synthesis, synteza), podczas której DNA chromosomów ulega replikacji, i w końcu zachodzi faza G2, okres, w którym komórka kontynuuje wzrost i zachodzi synteza białek jako przygotowanie do mitozy. Dla komórek eukariotycznych w hodowli komórkowej cykl komórkowy typowo trwa 16-24 godzin, ale dla niektórych komórek organizmów wielokomórkowych może być on też znacznie dłuższy (> 100 dni). Największe zróżnicowanie czasu trwania cyklu komórkowego dotyczy różnic w długości fazy G1. Niektóre komórki in vivo, takie jak neurony, całkowicie przestają się dzielić i są określane jako komórki spoczynkowe, zatrzymane w fazie G0 (rys. 1).

A4Obrazowanie komórek

Mikroskopia świetlna

W mikroskopii świetlnej używane są szklane soczewki do ogniskowania wiązki światła na badanym preparacie. Światło po przejściu przez preparat jest skupiane przez inne soczewki w celu otrzymania powiększonego obrazu.

Standardowo stosowane są różne rodzaje mikroskopii świetlnej dla badania rozmaitych aspektów budowy komórki. Najprostszą jest mikroskopia jasnego pola, w której preparat jest podświetlany od spodu przez źródło światła w podstawie mikroskopu (rys. 1), przy czym światło jest ogniskowane w płaszczyźnie preparatu przez soczewki kondensora. Padające światło po przejściu przez preparat jest wychwytywane przez soczewki obiektywu i skupiane w płaszczyźnie ogniskowej, dając powiększony obraz. Obraz ten jest dalej powiększany przez soczewkę okularu a ostateczne powiększenie uzyskuje się poprzez zsumowanie powiększeń dawanych przez poszczególne soczewki. Dla zwiększenia rozdzielczości osiąganej w mikroskopie świetlnym preparat jest często pokrywany olejkiem imersyjnym, w którym umieszczane są soczewki obiektywu. Granica rozdzielczości mikroskopii świetlnej z zastosowaniem światła widzialnego wynosi w przybliżeniu 0,2 ?m.

Utrwalanie i barwienie preparatów

W mikroskopii jasnego pola preparaty przed obserwacją są zwykle w pierwszej kolejności utrwalane roztworem zawierającym alkohol lub formaldehyd. Związki te denaturują białka, a w przypadku formaldehydu powodują powstanie kowalencyjnych wiązań poprzecznych (sieciowanie) między grupami aminowymi sąsiadujących cząsteczek, co stabilizuje oddziaływania białko-białko i białko-kwasy nuklei-nowe. Utrwalony preparat może być następnie zatopiony w wosku parafinowym lub w odpowiedniej żywicy, a następnie pocięty na cienkie skrawki (o grubości 0,5-10 ?m) przy użyciu mikrotomu. Każdy skrawek nakłada się na płytkę szklaną (zwaną szkiełkiem podstawowym), którą następnie umieszcza się na ruchomym stoliku mikroskopu (rys. 1). Różne wewnątrzkomórkowe składniki (jądro komórkowe, mitochondria, cytozol i inne) pochłaniają mniej więcej w tym samym stopniu światło widzialne, dlatego trudno je rozróżnić w mikroskopie świetlnym bez uprzedniego wybarwienia preparatu. Liczne barwniki chemiczne wiążą się z cząsteczkami biologicznymi; na przykład hematoksylina wiąże się z zasadowymi aminokwasami argininą (Arg) i lizyną (Lys) w białkach, a eozyna - z kwasowymi cząsteczkami [takimi jak DNA i łańcuchy boczne aminokwasów: kwasu asparaginowego (Asp) i kwasu glutaminowego (Glu)]. Barwienie cytochemiczne jest inną techniką wizualizacji specyficznych struktur w komórkach, w której w określonym miejscu enzym katalizuje powstanie z bezbarwnego prekursora wielu cząsteczek barwnego produktu reakcji. Produkt ten można następnie zobaczyć pod mikroskopem świetlnym wszędzie tam, gdzie jest obecny enzym. Na przykład peroksysomy mogą stać się widoczne po zastosowaniu cytochemicznego barwnika dla reakcji katalizowanej przez katalazę (patrz temat A2).

Mikroskopia z kontrastem fazowym

Gdy światło przenika żywą komórkę, faza fali świetlnej zmienia się zgodnie ze współczynnikiem załamania ośrodka, jakim jest komórka: światło przechodzące przez względnie grubą lub gęstą część komórki, taką jak jądro komórkowe, ulega opóźnieniu; w konsekwencji jego faza jest przesunięta w stosunku do światła, które przeszło przez sąsiedni cieńszy obszar cytoplazmy. Zarówno w mikroskopii z kontrastem fazowym, jak i w bardziej złożonej mikroskopii z kontrastem interferencyjno-różniczkowym (lub mikroskopii z kontrastem Nomarskiego[7]) wykorzystuje się efekty interferencji, powstające, gdy dwie różne fale światła ulegają rekombinacji, tworząc w ten sposób obraz struktury komórkowej. Ponieważ te rodzaje mikroskopii nie wymagają utrwalonych lub wybarwionych preparatów, są one przydatne przy badaniu większych organelli (jądra komórkowego, mitochondriów i innych) w żywych komórkach. Mikroskopię z kontrastem interferencyjno-różniczkowym ze wzmocnieniem rejestracją wideo można wykorzystać do wizualizacji ruchu organelli w komórkach, na przykład wzdłuż mikrotubul (patrz temat A2).

Mikroskopia fluorescencyjna

W mikroskopii fluorescencyjnej mikroskop świetlny jest przystosowany do wykrywania światła emitowanego przez związek fluorescencyjny, który wykorzystano dla selektywnego wybarwienia składników komórki. Uważa się, że związek jest fluorescencyjny, jeśli pochłania (absorbuje) światło o określonej długości fali (wzbudzająca długość fali) i następnie emituje światło o dłuższej długości fali (emisyjna długość fali). Dwa powszechnie stosowane związki w mikroskopii fluorescencyjnej to rodamina i czerwień teksańska, które emitują światło czerwone, oraz fluores-ceina, emitująca światło zielone. W pierwszej kolejności dodaje się do preparatu przeciwciało skierowane na badany antygen (tzw. przeciwciało pierwszorzędowe; patrz temat B6). Związek fluorescencyjny jest sprzęgany chemicznie z przeciwciałem drugorzędowym, które rozpoznaje przeciwciało pierwszorzędowe. Następnie znakowane fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe jest dodawane do skrawka tkanki lub rozszczelnionej komórki (komórki o zwiększonej przepuszczalności błony), a preparat zostaje oświetlony światłem o wzbudzającej długości fali (rys. 2). W ten sposób mogą zostać zobrazowane te struktury preparatu, z którymi związało się przeciwciało.

Mikroskopia konfokalna jest udoskonaleniem zwykłej mikroskopii fluorescencyjnej. Pozwala na uzyskanie wyraźniejszych obrazów całych komórek lub większych preparatów. W zwykłej mikroskopii fluorescencyjnej światło fluorescencyjne emitowane przez dany związek pochodzi z cząsteczek znajdujących się powyżej lub poniżej płaszczyzny ogniskowej, co powoduje rozmycie ostrości obrazu i utrudnia określenie rzeczywistego przestrzennego ułożenia cząsteczek. W mikroskopie konfokalnym fluoryzują tylko cząsteczki w płaszczyźnie ogniskowej w rezultacie użycia skupionej wiązki światła lasera o wzbudzającej długości fali. Wiązka laserowa przesuwana jest po różnych częściach preparatu, dzięki czemu można zarejestrować serię obrazów uzyskanych na różnej głębokości preparatu. Obrazy te są następnie przetwarzane przez komputer, w rezultacie dając pełny przestrzenny obraz. W mikroskopii dekonwolucyjnej uzyskuje się taką samą ostrość obrazu jak w mikroskopii konfokalnej, ale z zastosowaniem innego procesu.

Białko zielonej fluorescencji

Obrazowanie białek w żywych komórkach zostało zrewolucjonizowane przez odkrycie naturalnego białka fluorescencyjnego występującego u parzydełkowca Aequorea victoria. W tym zbudowanym z 238 aminokwasów białku, zwanym białkiem zielonej fluorescencji (ang. green fluorescent protein, GFP), pewne łańcuchy boczne aminokwasów ulegają spontanicznej cyklizacji, tworząc fluorofor emitujący zielną fluorescencję (tj. barwnik fluorescencyjny, który fluoryzuje na zielono). Stosując techniki rekombinacji DNA (patrz temat I1), można fragment DNA kodujący białko GFP przyczepić do sekwencji DNA kodującego inne białka i następnie taki DNA wprowadzić do żywych komórek w hodowli komórkowej lub do określonych komórek zwierzęcia. Komórki zawierające wprowadzony gen będą wtedy produkowały białko znakowane GFP, które będzie fluoryzowało na zielono podczas obserwacji w mikroskopie fluorescencyjnym. Lokalizację białka znakowanego GFP i jego ruchy można śledzić w żywych komórkach w czasie rzeczywistym. Do tej pory uzyskano różne warianty białka GFP, które emitują światło o różnej długości fali, na przykład białko szarobłękitnej (cyjanowej) fluorescencji (CFP) lub białko żółtej fluorescencji (YFP), umożliwiające jednoczesną wizualizację szeregu białek w tej samej komórce.

Metoda rezonansowego transferu energii fluorescencji (FRET)

Oddziaływania między białkami mogą być monitorowane za pomocą rezonansowego transferu energii fluorescencji (ang. fluorescence resonance energy transfer, FRET). Każde z dwóch określonych białek znakuje się innym fluorochromem (w postaci różnych wariantów białka GFP, patrz wyżej), dobranym w taki sposób, by spektrum emisji jednego fluorochromu zachodziło na spektrum wzbudzania drugiego (rys. 3a). Jeśli te dwa białka znajdą się w bardzo bliskiej odległości (mniejszej niż 2 nm), to energia pochłoniętego światła może zostać przeniesiona bezpośrednio z jednego fluorochromu na drugi (rys. 3c). Dlatego gdy próbka jest oświetlana światłem o wzbudzającej długości fali dla pierwszego fluorochromu, emitowane światło ma długość fali w zakresie spektrum emisji drugiego. Jeśli jednak dwa białka nie znajdą się w bliskiej odległości, nie będzie przenoszenia fluorescencji (rys. 3b).

Metoda odzyskiwania fluorescencji po fotowybieleniu (FRAP)

Boczny ruch białek w błonie może zostać uwidoczniony poprzez zastosowanie techniki odzyskiwania fluorescencji po fotowybieleniu (ang. fluorescence recovery after photobleaching, FRAP). W technice tej niewielki obszar komórki zawierającej białko znakowane GFP jest eksponowany na bardzo intensywny puls światła laserowego, co niszczy (wybiela) cząsteczki fluorescencyjne w tym miejscu. Następnie fluorescencję wybielonego obszaru monitoruje się w czasie, w którym inne znakowane fluorescencyjnie białka przemieszczą się do wybielonego obszaru błony. Szybkość odzyskiwania fluorescencji zależy od ruchliwości białka znakowanego fluorescencyjnie.

Mikroskopia elektronowa

W przeciwieństwie do mikroskopii świetlnej, w której optyczne soczewki skupiają wiązkę światła, w mikroskopii elektronowej wiązkę elektronów ogniskują soczewki elektromagnetyczne. Z uwagi na to, że elektrony mogłyby zostać pochłonięte (absorbowane) przez atomy występujące w powietrzu, preparat musi zostać umieszczony w próżni (wewnątrz specjalnej kolumny). Najwyższa rozdzielczość mikroskopu elektronowego dla materiału biologicznego wynosi 0,1 nm. W transmisyjnej mikroskopii elektronowej wiązkę elektronów kieruje się przez preparat, a soczewki elektromagnetyczne używane są do skupiania przechodzących elektronów w celu wytworzenia obrazu na ekranie monitora lub na kliszy fotograficznej (rys. 4a). Podobnie jak w standardowej mikroskopii świetlnej ogląda się cienkie skrawki preparatu. Jednak dla transmisyjnej mikroskopii elektronowej skrawki muszą być znacznie cieńsze (o grubości 50-100 nm). Ponieważ elektrony przenikają jednolicie przez materiał biologiczny, niewybarwione preparaty dają obrazy o bardzo niskiej jakości. Dlatego są one rutynowo barwione, aby rozproszyć niektóre z padających elektronów, które nie są wtedy ogniskowane przez elektromagnetyczne soczewki i nie biorą udziału w tworzeniu obrazu. Do barwienia materiału biologicznego wykorzystuje się często metale ciężkie, takie jak złoto i osm. W szczególności tetratlenek osmu wybiórczo barwi niektóre składniki komórki, takie jak błony, które na obrazach są czarne. Rozdzielczość transmisyjnej mikroskopii elektronowej jest wystarczająco duża, aby można ją było wykorzystać do otrzymywania informacji o kształcie oczyszczonych białek, wirusów i wewnątrzkomórkowych organelli. Przestrzenne obrazy struktur z rozdzielczością 2-10 nm można uzyskać przy zastosowaniu techniki tomografii elektronowej, która pozwala je wygenerować poprzez analizę komputerową licznych dwuwymiarowych obrazów uzyskanych w różnych kierunkach oglądania. Mikroskopia krioelektronowa, w której analizowane próbki są gwałtownie zamrażane w bardzo niskich temperaturach, jest wykorzystywana dla określania struktur przestrzennych białek (patrz temat B2).

Przeciwciała można znakować elektronowo gęstymi cząstkami złota w podobny sposób, jak są znakowane fluorescencyjnym barwnikiem w mikroskopii fluorescencyjnej. Wtedy mogą być wiązane do specyficznych białek docelowych w cienkim skrawku preparatu. Podczas oglądania w mikroskopie elektronowym na obrazie widoczne są małe ciemne plamy spowodowane cząsteczkami złota wszędzie tam, gdzie cząsteczka przeciwciała związała się ze swoim antygenem (patrz temat C4). Dlatego technika ta może być wykorzystywana do lokalizacji określonych białek.

W skaningowej mikroskopii elektronowej preparat (bez cięcia na skrawki) jest utrwalany i pokrywany cienką warstwą ciężkiego metalu, takiego jak platyna. Następnie wiązką elektronów omiata się (skanuje) preparat, wzbudzając zawarte w nim cząsteczki, które uwalniają wtórne elektrony. Te wtórne elektrony są skupiane w detektorze i wyświetla się otrzymany obraz (rys. 4b). Skaningowa mikroskopia elektronowa wytwarza przestrzenny obraz, ponieważ liczba elektronów wtórnych wytwarzanych przez dowolny punkt preparatu zależy od kąta padania wiązki elektronów względem powierzchni preparatu. Rozdzielczość mikroskopii skaningowej wynosi tylko około 10 nm.

A5Frakcjonowanie komórek

Izolowanie komórek i ich części: wprowadzenie

Większość tkanek zwierząt i roślin zawiera mieszaninę różnych typów komórek, a większość komórek posiada różnorodne organelle wewnątrzkomórkowe (patrz temat A2). Chociaż do obrazowania organelli i dużych cząsteczek wewnątrz komórek mogą być wykorzystane różne techniki mikroskopii (patrz temat A4), liczne badania nad strukturą i funkcją komórki wymagają próbki określonego typu komórek lub organelli wewnątrzkomórkowych, albo składników w nich zawartych. Większość procedur biochemicznych wymaga uzyskania dużej liczby komórek, a następnie fizycznego rozbicia ich w celu wyizolowania ich składników. Próbki tkanek często dostarczają olbrzymie ilości materiału, lecz stanowią heterogenną mieszaninę komórek. Dlatego opracowano techniki, za pomocą których można wyizolować homogenne (jednorodne) populacje komórek, namnażać je w hodowli, a następnie badać lub frakcjonować na poszczególne ich części składowe.

Cytometria przepływowa

Różne komórki można zidentyfikować, mierząc rozpraszane przez nie światło lub emitowaną przez nie fluorescencję, gdy przechodzą przez wiązkę światła lasera w cytometrze przepływowym. W wyniku zastosowania metody sortowania komórek aktywowanego fluorescencją określaną w skrócie FACS (ang. fluorescence-activated cell sorter) (rys. 1), w sprzęcie opartym na cytometrze przepływowym, komórki mogą zostać zidentyfikowane i rozdzielone. Badane komórki są najpierw znakowane przeciwciałem, które jest swoiste wobec określonej cząsteczki występującej na powierzchni komórki. Takie przeciwciało jest sprzęgane z fluorescencyjnym barwnikiem (patrz temat A4) w taki sposób, że mierzona jest fluorescencja każdej komórki, gdy poszczególne komórki płynące w wąskim strumieniu pojedynczo przechodzą przez wiązkę światła lasera. Następnie za pomocą dyszy drgającej tworzone są drobne kropelki zwierające pojedyncze komórki, przy czym otrzymują one dodatni lub ujemny ładunek w zależności od tego, czy komórka, którą zawierają, fluoryzuje, czy nie. Za pomocą silnego pola elektrycznego skierowuje się odmiennie naładowane kropelki do oddzielnych pojemników zbiorczych, że ostatecznie każdy taki kolektor zawiera homogenną (jednorodną) populację komórek pod względem cząsteczki sprzężonej z przeciwciałem na ich powierzchni. Te jednorodne populacje komórek mogą być następnie wykorzystane w badaniach biochemicznych lub utrzymywane w hodowli komórkowej. Zawartość DNA lub RNA w komórce można również zmierzyć w cytometrze przepływowym.

Frakcjonowanie subkomórkowe

W przeprowadzeniu badań makrocząsteczek lub procesów metabolicznych często pomaga oddzielenie organelli wewnątrzkomórkowych (patrz temat A2) jednego rodzaju od pozostałej zawartości komórki. Stosuje się wtedy metodę frakcjonowania subkomórkowego. Na początku trzeba rozbić błonę komórkową (a także ścianę komórkową, jeśli ta występuje). W tym celu tkankę lub próbkę komórek zawiesza się w izotonicznym roztworze sacharozy (0,25-0,32 M) o właściwym pH. Komórki następnie otwiera się przez homogenizację (w blenderze lub homogenizatorze) bądź sonikację, albo poddanie ich wysokiemu ciśnieniu (za pomocą tzw. prasy Frencha lub zjawiska kawitacji wykorzystującego tzw. bombę z ciekłego azotu). Homogenizację i następne frakcjonowanie zwykle przeprowadza się w temperaturze 4°C dla zminimalizowania degradacji składników komórki. Przed przystąpieniem do dalszych czynności próbka rozbitych komórek jest często przecedzana przez muślin lub inną cienką gazę dla usunięcia większych grudek materiału.

Wirowanie różnicowe

Różne wewnątrzkomórkowe organelle oddziela się od siebie, stosując wirowanie różnicowe opierające się na tym, że różni je rozmiar i gęstość. Struktury największe i najcięższe sedymentują najszybciej. Wirówka służy do generowania olbrzymich sił, ponad pół miliona razy większych od grawitacji (g). Próbka po homogenizacji zostaje umieszczona w specjalnej probówce wirówkowej, którą wstawia się do rotora wirówki i poddaje wirowaniu (rys. 2a). Początkowo przez krótki okres wirowania wykorzystuje się niskie siły, po czym przez coraz dłuższy czas stosowane są coraz większe siły. Dla przykładu, wirowanie przez 3 minuty przy 600 g osadzi na dnie probówki największe organelle - jądra komórkowe (rys. 2b). Zebrany na tym etapie supernatant przenosi się do nowej probówki i wiruje przez 8 minut przy 6000 g dla osadzenia mitochondriów, peroksysomów oraz, jeśli są obecne w materiale, lizosomów lub chloroplastów. Wirowanie otrzymanego supernatantu przez 30 minut przy 40 000 g osadza błony komórkowe oraz fragmenty retikulum endoplazmatycznego i aparatu Golgiego. Ostateczne wirowanie przy 100 000 g przez 90 minut pozwola uzyskać osad rybosomów oraz supernatant całkowicie wolny od cząstek stałych, który jest uważany za prawdziwą rozpuszczalną frakcję cytozolową. Jednak poszczególne frakcje otrzymane na drodze wirowania różnicowego zwykle nie są całkowicie wolne od innych organelli wewnątrzkomórkowych i dlatego wymagają dalszego oczyszczania. W rozdziałach przy niskich wartościach g stosuje się wirówkę preparacyjną, w której rotor wiruje w powietrzu o ciśnieniu otoczenia. Natomiast do rozdziałów przy wyższych wartościach g potrzebna jest ultrawirówka, w której komorze wirowania utrzymywania jest wysoka próżnia dla zredukowania tarcia i będącego jego następstwem nagrzewania, które wystąpiłyby, gdyby rotor obracał się w powietrzu.

Wirowanie równowagowe w gradiencie gęstości

Wirowanie równowagowe w gradiencie gęstości jest często stosowane do dalszego oczyszczania organelli po ich częściowym rozdzieleniu poprzez wirowanie różnicowe. W procedurze tej organelle są rozdzielane na podstawie ich gęstości. Frakcja zanieczyszczonych organelli jest nakładana na wierzch wypełniającego probówkę wirówkową gradientu gęstego roztworu (takiego jak roztwór sacharozy; rys. 3). Najbardziej stężony (o największej gęstości) roztwór sacharozy znajduje się przy dnie probówki, a ku górze probówki maleje stężenie (i gęstość) roztworu sacharozy. Podczas wirowania (np. 160 000 g przez 3 godziny) różne organelle przemieszczają się w kierunku dna probówki aż do poziomu równowagi, w której ich gęstość jest równa gęstości sacharozy na tym poziomie probówki. Siły powodujące sedymentację sprawiają, że organelle przemieszczają się dalej w dół probówki, ale wchodząc do obszaru o większej gęstości niż ich gęstość, unoszą się z powrotem do poprzedniego położenia. Mitochondria, lizosomy i peroksysomy różnią się gęstością i dlatego mogą być rozdzielone przez wirowanie w gradiencie gęstości (rys. 3). Podobnie, szorstkie retulikum endoplazmatyczne, aparat Golgiego i błona komórkowa mogą zostać rozdzielone przy zastosowaniu gradientu o mniejszej gęstości. Z kolei do rozdzielania bardziej gęstych cząstek, takich jak DNA, RNA i białka, techniką wirowania równowagowego w gradiencie gęstości do przygotowania gradientu stosuje się roztwór chlorku cezu o dużej gęstości.

Białka markerowe

Gdy próbka komórek zostanie poddana frakcjonowaniu, konieczne jest sprawdzenie czystości preparatów różnych organelli. Ocena ich morfologii za pomocą mikroskopii elektronowej jest jednym ze sposobów takiego sprawdzenia (patrz temat A4). Jednak alternatywnym, łatwiej dostępnym sposobem jest pomiar w badanej frakcji aktywności określonego enzymu (patrz temat D1), który jest charakterystyczny dla danej organelli i nie występuje nigdzie indziej w komórce. Na przykład katalaza jest dobrym enzymem markerowym dla peroksysomów, dehydrogenaza bursztynianowa dla mitochondriów, katepsyna C lub kwaśna fosfataza dla lizosomów, a zasadowa fosfataza dla błony komórkowej. Dlatego obecność katalazy we frakcji lizosomów może wskazywać na jej zanieczyszczenie peroksysomami. Dobre potwierdzenie czystości/stopnia zanieczyszczenia preparatu organelli można uzyskać poprzez pomiar aktywności takich enzymów markerowych w różnych wyizolowanych frakcjach. Zamiennie można wykrywać markerowe białka za pomocą elektroforezy SDS-PAGE (patrz temat C2) lub metodą western (western blot) ze swoistymi przeciwciałami (patrz temat C4).

B1Budowa aminokwasów

Aminokwasy

Aminokwasy są jednostkami budowy białek (patrz temat B2). Białka wszystkich gatunków, od bakterii do człowieka, są zbudowane z tych samych dwudziestu standardowych aminokwasów. Dziewiętnaście z nich to ?-aminokwasy z pierwszorzędową grupą aminową (-NH3+) i grupą kwasu karboksylowego (karboksyl; -COOH). Grupy te są połączone z centralnie położonym atomem węgla, nazywanym atomem węgla ? (C?), ze względu na sąsiedztwo z grupą karboksylową (rys. 1a). Z atomem C? jest połączony również atom wodoru i zmienny łańcuch boczny (grupa R). Jedynym wyjątkiem od tej powszechnie występującej reguły jest prolina, która zawiera drugorzędową grupę aminową i jest w rzeczywistości ?-iminokwasem. Nazwy aminokwasów przedstawia się często w postaci trójliterowych lub jednoliterowych skrótów. Przykładowo, w przypadku proliny są stosowane skróty Pro lub P (rys. 2).

Enancjomery

Wszystkie aminokwasy z wyjątkiem glicyny (Gly, G; rys. 2) zawierają cztery różne grupy ułożone tetraedrycznie wokół centralnego atomu C? nazywanego w związku z tym centrum asymetrii lub centrum chiralności i decydującego o powstaniu cząsteczki chiralnej (z gr. cheir - dłoń) (rys. 1b). Może ona występować w postaci jednego z dwóch nienakładających się na siebie lustrzanych odbić nazywanych enancjomerami. Przy wykorzystaniu większości technik enancjomery są fizycznie i chemicznie nierozróżnialne, ale można je odróżnić na podstawie różnic w kierunku skręcalności płaszczyzny światła spolaryzowanego. Cząsteczki klasyfikuje się jako prawoskrętne (D; z gr. dextro - prawy) lub lewoskrętne (L; z gr. levo - lewy), w zależności od tego, czy skręcają one płaszczyznę światła spolaryzowanego w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnym. D- i L-aminokwasy są rozróżniane przez enzymy, które zwykle rozpoznają tylko jeden enancjomer. W białkach występują tylko L-aminokwasy. D-aminokwasy występują rzadko, ale można je znaleźć w ścianie komórkowej bakterii (patrz temat A1) i w pewnych antybiotykach.

20 standardowych aminokwasów

Dwadzieścia standardowych aminokwasów różni się od siebie jedynie budową łańcucha bocznego (grupy R) (rys. 2 i 3). Biorąc pod uwagę podobieństwo właściwości łańcuchów bocznych, aminokwasy można podzielić na grupy. Aminokwasy wykazują różne właściwości fizykochemiczne, zależnie od natury łańcuchów bocznych. Niektóre z nich są kwasowe, inne zasadowe. Niektóre zawierają małe łańcuchy boczne, inne - łańcuchy o duże masie. Niektóre mają hydrofobowe (unikające wody) łańcuchy boczne, inne polarne lub hydrofilowe (lubiące wodę). Niektóre wykazują sztywność konformacji, inne uczestniczą w tworzeniu wiązań wodorowych lub kowalencyjnych. Niektóre są chemicznie reaktywne.

Hydrofobowe aminokwasy alifatyczne

W glicynie (Gly, G) (rys. 2a), najmniejszym aminokwasie o najprostszej budowie, pozycję łańcucha bocznego zajmuje atom wodoru. W cząsteczce glicyny występują więc dwie identyczne grupy (atomy wodoru) połączone z atomem C? i w związku z tym nie istnieje para enancjomerów. Alifatyczne łańcuchy boczne alaniny (Ala, A), waliny (Val, V), leucyny (Leu, L), izoleucyny (Ileu, I) i metioniny (Met, M) (rys. 2a) są chemicznie niereaktywne i hydrofobowe. Prolina (Pro, P) (rys. 2a) jest także hydrofobowa, ale jej alifatyczny łańcuch boczny jest połączony z grupą aminową, co prowadzi do usztywnienia konformacji. Zawierający siarkę łańcuch boczny cysteiny (Cys, C) (rys. 2a) jest również hydrofobowy, ale wysoce reaktywny. Może reagować z inną cząsteczką cysteiny i tworzyć wiązania disiarczkowe (patrz temat B2).

Hydrofobowe aminokwasy aromatyczne

Fenyloalanina (Phe, F), tyrozyna (Tyr, Y) i tryptofan (Trp, W) (rys. 2b) są hydrofobowe dzięki swym aromatycznym pierścieniom.

Polarne aminokwasy obdarzone ładunkiem

Wszystkie pozostałe aminokwasy zawierają polarne hydrofilowe łańcuchy boczne, z których niektóre są obdarzone ładunkiem w obojętnym pH. Grupy aminowe łańcuchów bocznych aminokwasów zasadowych, argininy (Arg, R) i lizyny (Lys, K) (rys. 3a), są w pH obojętnym uprotonowane - są więc obdarzone ładunkiem dodatnim. Łańcuch boczny histydyny (His, H) (rys. 3a) w obojętnym pH może być naładowany dodatnio lub pozbawiony ładunku. Z kolei grupy karboksylowe łańcuchów bocznych aminokwasów kwasowych, kwasu asparaginowego (asparaginian, Asp, D) i kwasu glutaminowego (glutaminian, Glu, E) (rys. 3a), w obojętnym pH ulegają deprotonacji i mają ładunek ujemny.

Polarne aminokwasy pozbawione ładunku

Łańcuchy boczne asparaginy (Asn, N) i glutaminy (Gln, Q) (rys. 3b), amidowych pochodnych Asp i Glu, nie są obdarzone ładunkiem, ale mogą uczestniczyć w tworzeniu wiązań wodorowych. Seryna (Ser, S) i treonina (Thr, T) (rys. 3b) są aminokwasami polarnymi dzięki zawartej w łańcuchu bocznym grupie hydroksylowej i mogą także uczestniczyć w tworzeniu wiązań wodorowych (tak jak grupa hydroksylowa aminokwasu aromatycznego Tyr).

Kwasy, zasady i pH

pH roztworu jest miarą stężenia protonów (H+). pH definiuje się za pomocą równania:

w którym nawias kwadratowy oznacza stężenie molowe.

Kwas może być definiowany jako donor protonów, a zasada - jako akceptor protonów.

kwas H+ + zasada

Na przykład:

W wyniku jonizacji kwasu powstaje sprzężona z nim zasada. I odwrotnie, protonacja zasady prowadzi do powstania sprzężonego z tą zasadą kwasu. Taką sprzężoną parę kwas-zasada tworzą, na przykład, kwas octowy i octan.

Równanie jonizacji słabego kwasu ma postać:

HA H+ + A-

Stałą równowagi (K) tej reakcji jonizacji definiuje się za pomocą równania:

pK kwasu definiuje się jako:

pK kwasu odpowiada takiemu pH, w obecności którego połowa tego kwasu ulega jonizacji (dysocjacji na jony), to jest gdy [A-] = [HA].

Równanie Hendersona-Hasselbalcha przedstawia zależność między pH a proporcją kwasu do zasady. Punktem wyjścia w uzyskaniu tego równania jest przekształcenie równania 1. W wyniku tego przekształcenia uzyskuje się równanie:

Po zlogarytmowaniu obu stron równania otrzymuje się:

Podstawiając w powyższym równaniu pH zamiast log 1/[H+] i pK zamiast log 1/K, uzyskuje się równanie:

nazywane równaniem Hendersona-Hasselbalcha. Równanie to wskazuje, że wartość pK kwasu jest równa pH roztworu, gdy stężenie molowe tego kwasu jest równe stężeniu sprzężonej z nim zasady. Ponadto pozwala na wyznaczenie pH roztworu, jeśli są znane stężenia molowe A- i HA oraz pK dla HA. Umożliwia ono również obliczenie pK kwasu, jeżeli znane są stężenia molowe A- i HA oraz pH roztworu.

Bufory

Sprzężona para kwas-zasada, taka jak kwas octowy i octan, jest odporna na zmiany pH roztworu. Oznacza to, iż działa jak bufor. W wyniku dodania jonów wodorotlenkowych (OH-) do roztworu kwasu octowego zachodzi reakcja:

CH3COOH + OH- CH3COO- + H2O

Krzywa zależności pH tego roztworu od ilości dodanych jonów OH- nazywana jest krzywą miareczkowania (rys. 4). Na krzywej tej istnieje punkt przegięcia w pH 4,8, co odpowiada pK kwasu octowego. W pobliżu tego pH stosunkowo duża ilość jonów OH- (lub H+) wywołuje niewielką zmianę pH, ponieważ dodawane jony OH- (lub H+) reagują odpowiednio z CH3COOH (lub CH3COO-). Słabe kwasy najskuteczniej przeciwdziałają zmianie pH roztworu, jeśli różni się ono nie więcej niż o jednostkę od ich pK (rys. 4). Właściwość ta, często przedstawiana w postaci wyrażenia pK ? 1, jest nazywana pojemnością buforową.

Płyny fizjologiczne, w tym cytozol i płyny zewnątrzkomórkowe jak krew, są buforowane; na przykład pH krwi zdrowych osób jest precyzyjnie utrzymywane na poziomie 7,4. W większości płynów fizjologicznych głównymi związkami buforującymi są jony fosforanowe (H2PO4-, pK 6,82) i jony wodorowęglanowe (HCO3-, pK 6,35), ponieważ ich wartości pK mieszczą się w wymaganym zakresie. Jednakże wiele biologicznych cząsteczek, w tym aminokwasy, białka, kwasy nukleinowe i lipidy, zawiera liczne grupy typu kwas-zasada, które stanowią skuteczne elementy buforujące w fizjologicznym zakresie pH (pH 6-8).

W pracy nad enzymami, białkami i innymi biologicznymi cząsteczkami często istotne znaczenie ma utrzymanie stałego pH roztworu, co pozwala na uniknięcie denaturacji (utraty aktywności) badanych cząsteczek (patrz temat D3). W tym celu w laboratoriach używane są różne bufory. Jednym z najczęściej stosowanych jest tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris), którego pK wynosi 8,08.

Jonizacja aminokwasów

Dwadzieścia standardowych aminokwasów zawiera dwie grupy typu kwas-zasada: grupę ?-aminową i grupę ?-karboksylową, połączone z atomem C?. Aminokwasy z łańcuchem bocznym podlegającym jonizacji (Asp, Glu, Arg, Lys, His, Cys, Tyr) mają dodatkową grupę typu kwas-zasada. Na rysunku 5a przedstawiono krzywą miareczkowania dla Gly. W niskim pH (tj. przy dużym stężeniu protonów) zarówno grupa aminowa, jak i karboksylowa są całkowicie uprotonowane, wskutek czego aminokwas występuje w postaci kationu H3N+CH2COOH (rys. 5b). Ponieważ w roztworze aminokwas podlega miareczkowaniu przez wzrastające ilości silnej zasady (np. NaOH), traci dwa protony, pierwszy z grupy karboksylowej o mniejszej wartości pK (pK = 2,3) i następnie drugi z grupy aminowej o większej wartości pK (pK = 9,78). Wartość pH, w którego obecności Gly ma zerowy ładunek wypadkowy, jest nazywana jej punktem izoelektrycznym, pI. Wartości pK grup ?-karboksylowych wszystkich standardowych 20 aminokwasów mieszczą się w granicach 1,8-2,5, a ich grup ?-aminowych - 8,7-10,7 (tab. 1). Dla łańcuchów bocznych aminokwasów kwasowych Asp i Glu wartości pK wynoszą odpowiednio 3,9 i 4,1, natomiast dla aminokwasów zasadowych Arg i Lys odpowiednio 12,5 i 10,5. Jedynie łańcuch boczny His, dla którego wartość pK wynosi 6, podlega jonizacji w fizjologicznym zakresie pH (6-8). Należy pamiętać o tym, że kiedy aminokwasy łączą się ze sobą w białku, jonizacji mogą podlegać jedynie ich łańcuchy boczne oraz końcowe grupy - ?-aminowa i ?-karboksylowa (patrz temat B2).

Tabela 1. Wartości pK i masy cząsteczek[10] 20 standardowych aminokwasów

B2Budowa i funkcje białek

Białka: przegląd

Białka to grupa najbardziej wszechstronnych makrocząsteczek występujących w organizmie, która wykonuje cały szereg różnych zadań. Białka transportują i magazynują inne cząsteczki (np. hemoglobina i mioglobina; patrz temat B3), stanowią mechaniczną podporę (np. kolagen; patrz temat B4), generują ruch (np. aktyna i miozyna; patrz temat B5), stanowią siły obronne organizmu (np. przeciwciała; patrz temat B6), pełnią funkcję katalizatorów (enzymy; patrz tematy D1-D5), są zaangażowane w procesy sygnalizacji komórkowej (patrz temat E5) i przekazują impulsy nerwowe (patrz temat E6). Każde białko ma swoją niepowtarzalną sekwencję aminokwasową zakodowaną w DNA (patrz temat H1). Większość białek liczy sobie od 50 do 200 aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi. Średnia masa molowa aminokwasu wynosi 110 (tab. 1 - patrz temat B1), stąd masa molowa większości białek waha się między 5500 a 220 000. Można również odwołać się do masy cząsteczkowej białka, wyrażanej w daltonach, gdzie 1 dalton jest równy jednej jednostce masy atomowej. Zatem białko o masie 25 000 ma masę cząsteczkową równą 25 000 daltonów, czyli 25 kDa.

Wiązanie peptydowe

Białka są liniowymi sekwencjami aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi. Wiązanie peptydowe to chemiczne wiązanie kowalencyjne powstające między grupą ?-aminową jednego aminokwasu i grupą ?-karboksylową kolejnego aminokwasu (rys. 1a) (patrz temat B1). Kiedy dwa aminokwasy zostaną połączone wiązaniem peptydowym, tworzą dipeptyd, na którego końcach nadal znajdują się wolna grupa aminowa i wolna grupa karboksylowa; każda z nich może się połączyć z kolejnym aminokwasem. Tak więc w długich, nierozgałęzionych łańcuchach aminokwasy mogą zostać połączone ze sobą wiązaniami peptydowymi do postaci oligopeptydów (do 25 reszt aminokwasów) i polipeptydów (> 25 reszt aminokwasów). Należy zauważyć, że polipeptyd nadal zawiera wolną grupę ?-aminową i wolną grupę ?-karboksylową. Zgodnie z przyjętą konwencją łańcuchy peptydowe zapisuje się w ten sposób, że wolna grupa ?-aminowa jest umieszczana po lewej stronie, wolna grupa ?-karboksylowa po prawej, a łącznik między aminokwasami oznacza wiązanie peptydowe. Tripeptyd +NH3-seryna-leucyna-fenyloalanina-COO- można zapisać także w prostszej postaci jako Ser-Leu-Phe (kod trójliterowy) lub S-L-F (kod jednoliterowy).

Dzięki bliskości wiązania podwójnego między węglem karbonylowym i tlenem, które umożliwia powstanie przedstawionych na rysunku 1b struktur rezonansowych, wiązanie peptydowe między węglem i azotem ma częściowo charakter wiązania podwójnego. Z tego powodu wiązanie C-N jest także krótsze niż zwykłe pojedyncze wiązanie C-N. Dlatego jednostka peptydowa, zbudowana z atomów CO-NH, jest stosunkowo sztywna i płaska, ale możliwa jest swobodna rotacja wokół wiązań C?-N i C?-C (a więc wiązań po obu stronach wiązania peptydowego), co umożliwia ułożenie sąsiednich jednostek peptydowych pod różnym kątem (rys. 1c). Wodór grupy aminowej prawie zawsze znajduje się w położeniu przeciwstawnym (trans) względem tlenu grupy karbonylowej, a nie w położeniu przyległym (cis).

Szkielet białka tworzą połączone kolejno sztywne i płaskie jednostki peptydowe. Układ przestrzenny tego szkieletu jest zdeterminowany przez kąty rotacji lub kąty torsyjne wokół wiązań C?-N (fi, ?) i C?-C (psi, ?) występujących w każdej reszcie aminokwasowej. W płaskim, całkowicie rozciągniętym łańcuchu polipeptydowym wartość każdego z kątów ? i ? wynosi 180o i wzrasta w przypadku rotacji zachodzącej względem C? zgodnie z ruchem wskazówek zegara (rys. 2). Zakres kombinacji wartości kątów torsyjnych ? i ? w łańcuchu polipeptydowym jest ograniczony z powodu przeszkody przestrzennej. Przestrzennie dozwolone wartości kątów ? i ? można wyznaczyć, obliczając odległość między atomami tripeptydu dla wszystkich wartości ? i ? wiązań C?-N i C?-C, w których uczestniczy centralnie położona jednostka peptydowa. Zakres wartości kątów torsyjnych można przedstawić za pomocą przestrzennego wykresu konturowego nazywanego mapą konformacyjną lub wykresem Ramachandrana (rys. 3). Analizując rysunek 3, można stwierdzić, że większość obszarów na wykresie Ramachandrana (czyli większość kombinacji wartości kątów ? i ?) jest konformacyjnie niedostępna dla łańcucha polipeptydowego. Tylko trzy małe obszary przedstawionej mapy konformacyjnej są fizycznie możliwe, a zawarte w ich granicach wartości ?-? odpowiadają prawoskrętnej helisie ?, równoległej i antyrównoległej strukturze ? oraz helisie kolagenowej (patrz poniżej i temat B4).

Łańcuch polipeptydowy zwija się, dzięki czemu powstaje specyficzny kształt (konformacja) białka. Konformacja to przestrzenne ułożenie atomów w strukturze, które można wyznaczyć na podstawie sekwencji aminokwasów. Istnieją cztery poziomy struktury białek określane jako struktury pierwszorzędowa, drugorzędowa, trzeciorzędowa i występująca czasami czwartorzędowa.

Struktura pierwszorzędowa

Struktura pierwszorzędowa białka to liniowa sekwencja aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi. Sekwencję tę wyznacza się na podstawie kolejności ułożenia zasad azotowych w genie kodującym dane białko (patrz temat H1). W strukturze pierwszorzędowej zawarte jest równocześnie położenie wszystkich innych wiązań kowalencyjnych. Są to głównie wiązania disiarczkowe między resztami cysteiny, sąsiadującymi ze sobą w przestrzeni, ale nie w sekwencji liniowej aminokwasów. Owe kowalencyjne sieciowania między odrębnymi łańcuchami polipeptydowymi lub między różnymi częściami tego samego łańcucha powstają na skutek utlenienia grup SH w resztach cysteiny, sąsiadujących ze sobą w przestrzeni (rys. 4). Powstały disiarczek jest nazywany resztą cystyny. Wiązania disiarczkowe występują często w białkach zewnątrzkomórkowych, natomiast rzadko w białkach wewnątrzkomórkowych. Niektóre białka, takie jak kolagen, zawierają kowalencyjne sieciowania między łańcuchami bocznymi reszt Lys (patrz temat B4).

Struktura drugorzędowa

Struktura drugorzędowa białka to regularne zwinięcie fragmentów łańcucha polipeptydowego. Najczęściej występującymi sposobami zwinięcia białka są helisa ? i struktura ?. W przypominającej cylinder helisie ? aminokwasy ustawiają się w ten sposób, że powstaje regularna konformacja określana potocznie jako spiralna (rys. 5a). Tlen karbonylowy każdego wiązania peptydowego jest połączony wiązaniem wodorowym z wodorem grupy aminowej czwartego z kolei aminokwasu (rys. 5b), przy czym wiązanie wodorowe przebiega prawie równolegle do osi helisy. Na jeden obrót helisy ? przypada 3,6 reszt aminokwasowych, co odpowiada 0,54 nm, natomiast odległość między dwoma aminokwasami wzdłuż osi helisy ? wynosi 0,15 nm (rys. 5a). Wszystkie łańcuchy boczne aminokwasów znajdują się na zewnątrz cylindrycznej helisy (rys. 5c). Pewne aminokwasy występują w helisie ? częściej niż inne. W helisie ? rzadko występuje prolina (Pro), która na skutek braku atomu wodoru związanego z atomem azotu nie może tworzyć prawidłowego układu wiązań wodorowych. Z tej przyczyny Pro występuje często na końcu helisy ?, ponieważ zmienia kierunek biegu łańcucha polipeptydowego i przerywa strukturę helisy. Różne białka wykazują różny stopień zwinięcia łańcucha polipeptydowego w helisę ?; na przykład mioglobina zawiera osiem helis ? (patrz temat B3).

W strukturze ? wiązania wodorowe powstają między wiązaniami peptydowymi różnych łańcuchów polipeptydowych lub różnych części tego samego łańcucha polipeptydowego (rys. 6a). Płaskie wiązanie peptydowe wymusza na łańcuchu polipeptydowym przyjęcie postaci pofałdowanej kartki z resztami bocznymi aminokwasów wystającymi powyżej lub poniżej płaszczyzny (rys. 6b). Łańcuchy polipeptydowe sąsiadujące ze sobą w strukturze ? mogą być ułożone równolegle lub antyrównolegle, zależnie od tego, czy biegną w tym samym, czy w przeciwnym kierunku (rys. 6c). Łańcuch polipeptydowy w obrębie struktury ? jest do tego stopnia rozciągnięty, że odległość między dwoma sąsiednimi atomami C? wynosi 0,35 nm. Struktury ? są zawsze lekko zakrzywione i gdy powstają z udziałem kilku łańcuchów polipeptydowych, mogą się zamknąć i utworzyć beczułkę ?[12]. Obecność wielu struktur ? w białkach strukturalnych przekłada się na ich wytrzymałość i sztywność, jak w przypadku fibroiny jedwabnika, która prawie całkowicie składa się z nakładających się warstw antyrównoległych struktur ?.

Tworząc ściśle upakowaną strukturę białka globularnego, łańcuch polipeptydowy często zmienia kierunek przebiegu, formując tak zwaną spinkę do włosów lub zwrot ?. W zwrotach ? tlen karbonylowy jednego aminokwasu jest połączony wiązaniem wodorowym z wodorem grupy aminowej czwartego z kolei aminokwasu (rys. 7). Zwroty ? często łączą końce antyrównoległych struktur ?. Rejony łańcucha polipeptydowego pozbawione regularnej struktury drugorzędowej przyjmują konformację zwoju lub pętli. Taką postać może przyjąć ponad połowa łańcucha polipeptydowego typowego białka globularnego.

Struktura trzeciorzędowa

Struktura trzeciorzędowa dotyczy przestrzennego ułożenia aminokwasów zarówno odległych w sekwencji liniowej, jak i tych, które ze sobą sąsiadują. O ostatecznej strukturze przestrzennej polipeptydu decyduje sekwencja aminokwasowa (rys. 8 i 9). W przypadku rozpuszczalnych w wodzie białek globularnych, takich jak mioglobina (patrz temat B3), podstawową siłą odpowiedzialną za zwijanie się łańcucha polipeptydowego jest energetyczny wymóg oddzielenia niepolarnych aminokwasów od wodnego, hydrofilowego otoczenia przez schowanie ich w hydrofobowym wnętrzu. Łańcuch polipeptydowy zwija się spontanicznie w ten sposób, że większość jego hydrofobowych łańcuchów bocznych zostaje skierowana do wnętrza powstającej struktury, a większość jego polarnych, obdarzonych ładunkiem łańcuchów bocznych znajduje się na jej powierzchni. Biologicznie aktywna (natywna) przestrzenna konformacja białka jest utrzymywana nie tylko dzięki oddziaływaniom hydrofobowym, ale i przez siły elektrostatyczne, wiązania wodorowe i, jeśli obecne, kowalencyjne wiązania disiarczkowe. Siły elektrostatyczne obejmują wiązania jonowe między przeciwstawnie naładowanymi grupami oraz liczne słabe oddziaływania van der Waalsa między ściśle upakowanymi alifatycznymi łańcuchami bocznymi we wnętrzu białka.

W przypadku dużych białek łańcuch polipeptydowy zwija się w dwa lub więcej zwarte regiony globularne nazywane domenami. Większość domen zbudowana jest z 30-400 aminokwasów, w obrębie których łańcuch polipeptydowy zwija się w określone struktury oddzielone od siebie względnie nieustrukturyzowanymi rejonami łącznikowymi. W efekcie wiele domen stanowi niezależne jednostki strukturalne z cechami charakterystycznymi dla małych białek globularnych. Niespokrewnione ze sobą białka mogą mieć takie same domeny, nawet jeśli ich całkowita struktura przestrzenna jest zupełnie różna. Przykłady domen białkowych to: zwinięcie immunoglobulinowe, charakterystyczne dla przeciwciał i innych białek układu odpornościowego (patrz temat B6), lub domena helisa-zwrot-helisa, palec cynkowy i domena zasadowa - identyfikowane w białkach wiążących DNA (patrz temat G6).

Struktura czwartorzędowa

W przypadku białek zawierających więcej niż jeden łańcuch polipeptydowy, takich jak hemoglobina (patrz temat B3), występuje najwyższy poziom organizacji białka nazywany strukturą czwartorzędową (rys. 8). Ten poziom struktury białka jest związany z przestrzennym ułożeniem polipeptydowych podjednostek i naturą oddziaływań między nimi. Tymi oddziaływaniami mogą być wiązania kowalencyjne (np. wiązania disiarczkowe) lub oddziaływania niekowalencyjne (siły elektrostatyczne, wiązania wodorowe i oddziaływania hydrofobowe).

Stabilność białka

Natywna struktura przestrzenna białka jest utrzymywana przez zestaw wiązań niekowalencyjnych (siły elektrostatyczne, wiązania wodorowe, oddziaływania hydrofobowe) i wiązania kowalencyjne, czyli wiązania disiarczkowe i wiązania peptydowe łączące kolejne aminokwasy w białku.

- Siły elektrostatyczne: obejmują oddziaływania między dwiema grupami jonowymi o przeciwstawnym ładunku, często nazywane również parą jonową lub mostkiem solnym (lub wiązaniem jonowym - przyp. red.). Tego typu oddziaływanie zachodzi na przykład między grupą aminową Lys i grupą karboksylową Asp. Do tego typu oddziaływań zaliczają się też niekowalencyjne oddziaływania pomiędzy elektrycznie obojętnymi cząsteczkami, określane łącznie mianem oddziaływań van der Waalsa. Polegają one na oddziaływaniach elektrostatycznych między trwałymi i/lub indukowanymi dipolami, takimi jak grupy karbonylowe w wiązaniach peptydowych.

- Wiązania wodorowe: to najczęściej oddziaływania elektrostatyczne między grupą donorową, będącą słabym kwasem, a atomem akceptorowym, zawierającym wolną parę elektronów i mającym dzięki temu cząstkowy ładunek ujemny, co z kolei jest czynnikiem przyciągającym atom wodoru. W układach biologicznych grupą donorową jest atom tlenu lub atom azotu połączony kowalencyjnie z atomem wodoru, a akceptorem - atom tlenu lub azotu (rys. 10). Wiązania wodorowe mają długość 0,27-0,31 nm i ściśle ukierunkowany charakter, to znaczy że donor, atom wodoru, i akceptor leżą w jednej linii (są ułożone kolinearnie). Wiązania wodorowe są silniejsze niż oddziaływania van der Waalsa, ale dużo słabsze niż wiązania kowalencyjne. Odgrywają istotną rolę w tworzeniu struktury przestrzennej nie tylko białek, ale i innych biologicznych makrocząsteczek, takich jak dwuniciowa helisa DNA (patrz temat F1) czy dwuwarstwa lipidowa (patrz temat E1). Ponadto wiązania wodorowe mają kluczowe znaczenie zarówno dla właściwości wody, jak i jej roli jako rozpuszczalnika biochemicznego.

- Siły hydrofobowe: to oddziaływania będące skutkiem efektu hydrofobowego odpowiedzialnego za minimalizowanie powierzchni kontaktu niepolarnych cząsteczek z otaczającą je wodą. Można je łatwo zaobserwować w przypadku cząsteczek amfipatycznych, takich jak lipidy i detergenty, tworzących micele w środowisku wodnym (patrz temat E1). W procesie zwijania się białka dochodzi także do eliminowania kontaktu między niepolarnymi łańcuchami bocznymi i roztworem wodnym. Dlatego siły hydrofobowe są istotnym czynnikiem warunkującym strukturę białek, ich zwijanie i stabilność. W przypadku białek działanie sił hydrofobowych określa się mianem oddziaływań hydrofobowych, co służy podkreśleniu ważnej roli tych sił w procesie zwijania się białka.

- Wiązania disiarczkowe: wiązania kowalencyjne powstające między dwiema resztami cysteiny, położonymi blisko siebie w natywnej strukturze przestrzennej białka (rys. 4), których funkcja polega na stabilizacji tej trójwymiarowej struktury. Wiązania disiarczkowe powstają w utleniającym środowisku retikulum endoplazamtycznego (patrz temat A2) i dlatego można je głównie znaleźć w białkach wydzielanych na zewnątrz komórki.

Wyznaczanie struktury białka

Obecność helisy ? i struktury ? w białku można zazwyczaj przewidzieć na podstawie sekwencji aminokwasów, jednak określenie dokładnej struktury przestrzennej białka na podstawie jego sekwencji aminokwasowej jest często niemożliwe, jeśli sekwencja ta nie jest bardzo podobna do sekwencji białka o już określonej strukturze przestrzennej. Wyznaczenie struktury przestrzennej białka wymaga zastosowania wyszukanych metod fizycznych i skomplikowanej analizy danych eksperymentalnych. Można ją wyznaczyć, stosując krystalografię rentgenowską, spektroskopię jądrowego rezonansu magnetycznego i mikroskopię krioelektronową.

Krystalografia rentgenowska wymaga przede wszystkim uzyskania kryształów oczyszczonego białka. W krysztale miliony atomów białka zostają zestawione w sposób uporządkowany w sieć charakterystyczną dla danego białka. Przez uzyskany kryształ przepuszczane są wiązki promieni rentgenowskich (rys. 11). Długość fali promieni rentgenowskich mieści się w granicach 0,1-0,2 nm, czyli fale te są wystarczająco krótkie, by uzyskać strukturę białka z rozdzielczością atomową. Atomy w krysztale rozpraszają promienie rentgenowskie, co prowadzi do uzyskania charakterystycznego dla danego białka wzoru dyfrakcyjnego, widocznego jako zbiór indywidualnych plamek na kliszy rentgenowskiej. Intensywność maksimów dyfrakcyjnych (intensywność zaczernienia plamek na kliszy) jest poddawana analizie matematycznej, co z kolei umożliwia uzyskanie przestrzennego obrazu kryształu białka.

Spektroskopia jądrowego rezonansu magnetycznego (ang. nuclear magnetic resonance, NMR) może być wykorzystana do wyznaczania struktury przestrzennej małych (w przybliżeniu 30 kDa) białek w roztworze wodnym. Technika ta nie wymaga krystalizacji białka. Stężony roztwór białka umieszcza się w polu magnetycznym i następnie mierzy się skutki promieniowania radiowego[13] o różnej częstotliwości na spin różnych atomów w badanym białku. Zachowanie poszczególnych atomów jest modyfikowane przez sąsiadujące z nimi atomy przylegających reszt aminokwasowych, przy czym reszty położone bliżej wywołują silniejsze zaburzenia niż reszty położone dalej. Na podstawie siły efektu oblicza się odległości między resztami, które wykorzystuje się następnie przy wyznaczaniu struktury przestrzennej białka.

Mikroskopia krioelektronowa jest często stosowana do wyznaczania struktur białek, szczególnie białek zbudowanych z wielu podjednostek, dla których trudno jest uzyskać kryształ. W technice tej preparat białka jest szybko zamrażany w ciekłym helu, co umożliwia zachowanie struktury białka. Zamrożone, uwodnione białko jest następnie analizowane za pomocą mikroskopu krioelektronowego z wykorzystaniem niewielkiej dawki elektronów, co zapobiega indukowanym promieniowaniem uszkodzeniom struktury białka. Uzyskane obrazy analizuje się za pomocą skomplikowanych programów komputerowych, co pozwala odtworzyć strukturę przestrzenną białka.

Zwijanie się białek

W odpowiednich warunkach fizjologicznych białka zwijają się spontanicznie, osiągając natywną konformację. Proces ten nie wymaga udziału żadnej zewnętrznej matrycy, co oznacza, że struktura przestrzenna białka jest determinowana przez jego strukturę pierwszorzędową. Wyniki badań nad białkiem RNazą A dowodzą, że o zwijaniu się białka w natywną strukturę przestrzenną decydują głównie jego reszty aminokwasowe kierowane do wnętrza powstającej struktury. Zmiana drogą mutacji reszt aminokwasowych na powierzchni białka ma bowiem mniejszy wpływ na proces jego zwijania się niż zmiana reszt znajdujących się wewnątrz białka. Stwierdzono także, że główną siłą kierującą zwijaniem się białka są oddziaływania hydrofobowe. Białka osiągają natywną konformację dzięki zbiorowi ciągów uporządkowanych wydarzeń, a nie metodą prób i błędów.

W warunkach in vitro (w laboratorium) białka mogą zwijać się bez udziału białek pomocniczych, jednak proces ten jest długotrwały (minuty, dni). W warunkach in vivo (w komórce) przebiega on szybko (kilka minut), ponieważ w komórkach znajdują się białka pomocnicze, które wspomagają zwijanie się polipeptydów i osiągnięcie natywnej konformacji. Wyróżnia się trzy klasy białek pomocniczych wspomagających zwijanie się białek:

- izomerazy wiązań disiarczkowych katalizują tasowanie mostków disiarczkowych w białku aż do uzyskania prawidłowych połączeń;

- izomerazy peptydylo-prolilowe cis-trans przyspieszają (wolny w przypadku ich nieobecności) proces przekształcania wiązania peptydowego X-Pro (X oznacza dowolny aminokwas) z konfiguracji cis w trans, co ułatwia zwijanie się polipeptydów zawierających prolinę; inhibitorem jednej z klas izomeraz peptydylo-prolilowych cis-trans jest lek immunosupresyjny cyklosporyna A;

- białka opiekuńcze (molekularne czaperony), do których zalicza się białka szoku termicznego 70 (Hsp70), chaperoniny oraz lektyny - kalneksynę i kalretikulinę; zapobiegają one nieprawidłowemu zwijaniu się białek i ich agregacji, mogących się pojawić w warunkach sprzyjających oddziaływaniu rejonów hydrofobowych kierowanych do wnętrza białka.

Przyczyną niektórych chorób jest nieprawidłowe zwinięcie białek. W przypadku śmiertelnej choroby neurodegeneracyjnej - choroby Alzheimera - nieprawidłowemu zwinięciu ulega mały peptyd ?-amyloidowy, co prowadzi do jego agregacji w mózgu i zniszczenia sąsiednich neuronów. W infekcyjnej chorobie prionowej, takiej jak choroba Creutzfeldta-Jakoba (ang. Creutzfeld-Jakob disease, CJD) u ludzi i gąbczasta encefalopatia bydła (ang. bovine spongiform encephalopathy, BSE, zwanej także chorobą wściekłych krów), prawidłowa forma komórkowego białka prionowego, zawierająca głównie drugorzędowe struktury typu helisa ?, podlega przemianie konformacyjnej do formy infekcyjnej białka, zawierającej głównie strukturę ?.

Dane oryginału:

Instant Notes. Biochemistry

fourth edition

B.D. Hames; N.M. Hooper

Copyright ? Taylor & Francis Group

All rights reserved

Authorised translation from the English language edition published by Taylor & Francis, a member of the Taylor & Francis Group.

Wydanie polskie:

Projekt okładki i strony tytułowej Lidia Michalak

Ilustracja na okładce Mrcu tuio/Shutterstock

Wydawca Katarzyna Włodarczyk-Gil

Koordynator ds. redakcji Renata Ziółkowska

Redakcja i korekta Monika Gołaszewska

Produkcja Adam Krajewski

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwo Naukowe PWN Michał Latusek

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw, jakie im przysługują. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim lub osobiście znanym. Ale nie publikuj jej w Internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło. A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty. Szanujmy cudzą własność i prawo.

Więcej na www.legalnakultura.pl

Polska Izba Książki

Copyright ? for the Polish edition by Wydawnictwo Naukowe PWN SA

Warszawa 1999, 2002, 2010, 2021

ISBN 978-83-01-21909-3

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2021r. (Wydanie IV)

Warszawa 2021

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321; faks 22 69 54 288; infolinia 801 33 33 88

e-mail: [email protected]; [email protected]

www.pwn.pl

Przedmowa

Mija pięć lat od trzeciego wydania Krótkich wykładów. Biochemia. W tym czasie w biochemii sporo się wydarzyło i można powiedzieć, że był to czas fascynujących odkryć w wielu jej obszarach. Nie dziwi więc, że - podobnie jak inni autorzy podręczników dla studentów - pragnęliśmy opowiedzieć wszystko o postępie, który się dokonał. Jednakże, przyczyną przygotowania wiele lat temu wydania pierwszego było przedstawienie studentowi pierwszego roku jedynie podstawowych informacji jako solidnej podstawy przyszłych lat studiów. Zatem nowe wydanie pozostaje w zgodzie z tym wyjściowym założeniem, ale przygotowując je, skorzystaliśmy z możliwości uaktualnienia zawartych w nim treści.

Jesteśmy głęboko przekonani, że podobnie jak w przypadku wcześniejszych wydań podręcznik ten umożliwi studentom szybkie odnalezienie i zrozumienie podstawowych faktów i pojęć z danego tematu. Dla tych, którzy pragną wiedzieć więcej, w końcowej części (Literatura uzupełniająca) zebraliśmy szczegółowe informacje dotyczące wiodących podręczników biochemii, które przenoszą Czytelnika do najnowszych zagadnień oraz szczegółowych przeglądów poszczególnych obszarów tematycznych.

Niniejsza publikacja jest przede wszystkim skierowana do studentów pierwszego i drugiego roku studiów, na co zwróciliśmy już uwagę w Przedmowie do wydania trzeciego. Jednak z własnego doświadczenia w kształceniu studentów wiemy, że podręcznik ten szybko staje się cennym i wieloletnim towarzyszem, który sprawdza się w sytua-cji wymagającej odświeżania wiedzy. Stąd dla wielu studentów jest on przydatnym zestawem powtórkowym.

Podczas pisania czwartego wydania dokonaliśmy aktualizacji wszystkich podstawowych obszarów tematycznych. Naszym ogólnym celem było stworzenie podręcznika mniej więcej tej samej wielkości, co przygotowane wcześniej wydanie trzecie. Taka decyzja wynika z wyrażonego przez studentów i nauczycieli zapotrzebowania na stosunkowo niewielką książkę, która - w przeciwieństwie do ogólnie dostępnych podręczników - wyraźnie koncentruje się najważniejszych kwestiach.

Na koniec kilka słów do Czytelnika. Podobnie jak inne obszary wiedzy na poziomie zaawansowanym, biochemia może wydawać się Tobie zniechęcająca (chociaż intelektualnie bardzo satysfakcjonująca). Podręcznik ten jest napisany w taki sposób, abyś nie musiał go czytać od deski do deski. Dzięki niemu możesz pogłębić wiedzę z kursu biochemii na Twojej uczelni, odnajdując zrozumiałe i przydatne wskazówki. Zachowaj ten podręcznik na czas trudnych egzaminów, bowiem sprawdzi się jako pomoc w szybkiej powtórce i upewni, że znasz podstawy. Mamy nadzieję, że podobnie jak Czytelnicy poprzednich wydań uznasz go za równie użyteczny.

David Hames

Nigel Hooper

Wykaz skrótów

2,3-BPG

2,3-bisfosfoglicerynian (ang. 2,3-bisphosphoglycerate)

?E0'

zmiana potencjału oksydoredukcyjnego w standardowych warunkach (ang. change in redox potential under standard conditions)

?G

zmiana energii swobodnej Gibbsa (ang. Gibbs free energy)

?G?

energia swobodna aktywacji Gibbsa (ang. Gibbs free energy of activation)

?G0'

zmiana energii swobodnej w warunkach standardowych (ang. Gibbs free energy of activation under standard conditions)

ACP

białkowy nośnik grup acylowych (ang. acyl carrier protein)

ADP

adenozynodifosforan (ang. adenosine diphosphate)

AIDS

zespół nabytego niedoboru odporności (ang. acquired immunodeficiency syndrome)

Ala

alanina (ang. alanine)

ALA

kwas aminolewulinowy, aminolewulinian (ang. aminolevulinic acid)

AMP

adenozynomonofosforan (ang. adenosine monophosphate)

Arg

arginina (ang. arginine)

Asn

asparagina (ang. asparagine)

Asp

kwas asparaginowy, asparaginian (ang. aspartic acid)

ATCaza

karbamoilotransferaza asparaginianowa (ang. aspartate transcarbamoylase)

ATP

adenozynotrifosforan (ang. adenosine triphosphate)

ATPaza

adenozynotrifosfataza, także syntaza ATP (ang. adenosine triphosphatase)

BSE

gąbczasta encefalopatia bydła (ang. bovine spongiform encephalopathy)

bZIP

główne białko zamka leucynowego (ang. basic leucine zipper protein)

C?

atom węgla ? (ang. ?-carbon atom)

cAMP

cykliczny adenozynomonofosforan, także cykliczny AMP (ang. cyclic adenosine monophosphate)

CAP

białko aktywujące geny kataboliczne (ang. catabolite activator protein)

cDNA

DNA komplementarny do mRNA (ang. complementary DNA)

CDP

cytydynodifosforan (ang. cytidine diphosphate)

CFP

białko cyjanowej fluorescencji (ang. cyan fluorescent protein)

CFTR

regulator przewodnictwa błonowego związany z mukowiscydozą (ang. cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)

cGMP

cyliczny guanozynomonofosforan, także cykliczny GMP (ang. cyclic guanosine monophosphate)

CJD

choroba Creutzfeldta-Jakoba (ang. Creutzfeldt-Jakob disease)

CM

karboksymetyl (ang. carboxymethyl)

CNBr

bromek cyjanogenu (ang. cyanogen bromide)

CoA

koenzym A (ang. coenzyme A)

COPI

białko płaszcza (ang. coat protein)

CRE

element odpowiedzi na cykliczny AMP (cAMP) (ang. cAMP response element)

CRP

receptor cAMP (ang. cAMP receptor protein)

CStF

czynnik stymulujący cięcie (ang. cleavage stimulation factor F)

CTD

domena końca C (ang. C-terminal domain)

CTP

cytydynotrifosforan (ang. cytidine triphosphate)

Cys

cysteina (ang. cysteine)

DAG

diacyloglicerol (ang. 1,2-diacylglycerol)

dATP

5'-trifosforan deoksyadenozyny (ang. deoxyadenosine 5'-triphosphate)

dCTP

5'-trifosforan cytydyny (ang. cytidine 5'-triphosphate)

DEAE

dietyloaminoetyl (ang. diethylaminoethyl)

dGTP

5'-trifosforan deoksyguanozyny (ang. deoxyguanosine 5'-triphosphate)

DIPF

diizopropylofluorofosforan (ang. diisopropylfluorophosphate)

DNA

kwas deoksyrybonukleinowy (ang. deoxyribonucleic acid)

dNDP

5'-difosforan deoksyrybonukleozydu (ang. deoxyribonucleoside 5'-diphosphate)

dNMP

5'-monofosforan deoksyrybonukleozydu (ang. deoxyribonucleoside 5'-monophosphate)

DNP

2,4-dinitrofenol (ang. 2,4-dinitrophenol)

dNTP

5'-trifosforan deoksyrybonukleozydu (ang. deoxyribonucleoside 5'-triphosphate)

DPE

element promotorowy położony poniżej (ang. downstream promoter element)

dsRNA

dwuniciowy RNA (ang. double-stranded RNA)

dTTP

5'-trifosforan deoksytymidyny (ang. deoxythymidine 5'-triphosphate)

E

energia

Eo'

potencjał redoks w warunkach standardowych (ang. standard redox potential)

EC

Komisja Enzymów (ang. Enzyme Commission)

eIF

eukariotyczny czynnik inicjujący (ang. eukaryotic initiation factor)

EKG

elektrokardiogram (ang. electrocardiogram)

ELISA

test immunoenzymatyczny (ang. enzyme-linked immunosorbent assay)

ER

retikulum endoplazmatyczne (ang. endoplasmic reticulum)

EtP

fosforan etanolaminy (ang. ethanolamine phosphate)

F-2,6-BP

fruktozo-2,6-bisfosforan (ang. fructose 2,6-bisphosphate)

Fab

fragment wiążący antygen (ang. fragment antigen binding)

FACS

sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (ang. fluorescence-activated cell sorter)

FAD

dinukleotyd flawinoadeninowy (ang. flavin adenine dinucleotide)

FBPaze2

fruktozobisfosfataza 2 (ang. fructose bisphosphatase 2)

FMN

mononukleotyd flawinowy (ang. flavin mononucleotide)

FRAP

odzyskiwanie fluorescencji po fotowybieleniu (ang. fluorescence recovery after photobleaching)

FRET

rezonansowy transfer energii fluorescencji (ang. fluorescence resonance energy transfer)

G

energia swobodna Gibbsa (ang. Gibbs free energy)

GDP

guanozynodifosforan (ang. guanosine diphosphate)

GEF

czynnik wymiany nukleotydów guaninowych (ang. guanine nucleotide-exchange factor)

GFP

białko zielonej fluorescencji (ang. green fluorescent protein)

GlcNAc

N-acetyloglukozamina (ang. N-acetylglucosamine)

Gln

glutamina (ang. glutamine)

Glu

kwas glutaminowy (ang. glutamic acid)

GLUT1

transporter lub uniporter glukozy w erytrocytach (ang. erythrocyte glucose transporter or uniporter)

Gly

glicyna (ang. glycine)

GPCR

receptor związany z białkiem G (ang. G protein-coupled receptor)

GPI

glikozylofosfatydyloinozytol (ang. glycosyl-phosphatidylinositol)

GTP

guanozynotrifosforan (ang. guanosine triphosphate)

H

entalpia

HbA

hemoglobina osoby dorosłej (ang. adult hemoglobin)

HbF

hemoglobina płodu (ang. hemoglobin F)

HbS

hemoglobina krwinek sierpowatych (ang. sickle-cell hemoglobin)

HDL

lipoproteina o dużej gęstości (ang. high density lipoprotein)

His

histydyna (ang. histidine)

HIV

ludzki wirus niedoboru odporności (ang. human immunodeficiency virus)

HLH

motyw helisa-pętla-helisa (ang. helix-loop-helix)

HMG

3-hydroksy-3-metyloglutaryl (ang. 3-hydroxy-3-methylglutaryl-)

HMM

meromiozyna ciężka (ang. heavy meromyosin)

HPLC

wysokosprawna chromatografia cieczowa (ang. high-performance liquid chromatography)

Hsp

białko szoku cieplnego (ang. heat shock protein)

HTH

motyw helisa-zwrot-helisa (ang. helix-turn-helix)

Hyl

5-hydroksylizyna (ang. 5-hydroxylysine)

Hyp

4-hydroksyprolina (ang. 4-hydroxyproline)

IDL

lipoproteina o pośredniej gęstości (ang. intermediate density lipoprotein)

IF

czynnik inicjujący (ang. initiation factor)

IgA

immunoglobulina A (ang. immunoglobulin A)

IgG

immunoglobulina G (ang. immunoglobulin G)

IgM

immunoglobulina M (ang. immunoglobulin M)

Ile

izoleucyna (ang. isoleucine)

IP3

trisfosforan inozytolu, inozytolo-1,4,5- trisfofosforan (ang. inositol 1,4,5-trisphosphate)

IPTG

izopropylotiogalaktozyd (ang. isopropyl-D-thiogalactopyranoside)

IRES

wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu (ang. internal ribosome entry site)

ITS

wewnętrzna sekwencja transkrybowana (ang. internal transcribed spacer)

K

stała równowagi (ang. equilibrium constant)

kb

szybkość reakcji w kierunku odwrotnym

kf

szybkość reakcji w kierunku do przodu

Km

stała Michaelisa (ang. Michaelis constant)

LCAT

acylotransferaza lecytyna:cholesterol (ang. lecithin:cholesterol acyltransferase)

LDH

dehydrogenaza mleczanowa (ang. lactate dehydrogenase)

LDL

lipoproteina o małej gęstości (ang. low density lipoprotein)

Leu

leucyna (ang. leucine)

LMM

meromiozyna lekka (ang. light meromyosin)

MALDI-TOF

spektrometria wykorzystująca jonizację laserem wspomaganą matrycą i analizator czasu przelotu (ang. matrix-assisted laser desorption ionisation-time-of-flight spectrometry)

MAPK

kinaza białkowa aktywowana mitogenem (ang. mitogen-activated protein kinase)

Met

metionina (ang. methionine)

miRISC

kompleks wyciszający indukowany przez miRNA (ang. miRNA-induced silencing complex)

miRNA

mikroRNA (ang. microRNA)

miRNP

kompleks mikrorybonukleoproteinowy (ang. microribonucleoprotein)

mRNA

informacyjny RNA (ang. messenger RNA)

MS

spektrometria mas (ang. mass spectrometry)

MWC

model Monoda-Wymana-Changeauxa (ang. Monod-Wyman-Changeaux model)

NAD+

dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (ang. nicotinamide adenine dinucleotide)

NADH

zredukowany dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (ang. reduced nicotinamide adenine dinucleotide)

NADP+

fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (ang. nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)

NADPH

zredukowany fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (ang. reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)

NAM

kwas N-acetylomuraminowy (ang. N-acetylmuramic acid)

NHP

białko niehistonowe (ang. nonhistone protein)

NMR

jądrowy rezonans magnetyczny (ang. nuclear magnetic resonance)

NOS

syntaza tlenku azotu (ang. nitric oxide synthase)

Nt

nukleotyd (ang. nucleotide)

ORC

kompleks inicjujący replikacje (ang. origin replication complex)

ORF

otwarta ramka odczytu (ang. open reading frame)

ORT

doustna terapia nawodnieniowa (ang. oral rehydration therapy)

P

ciśnienie (ang. pressure)

PAGE

elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (ang. polyacrylamide gel electrophoresis)

PAP

polimeraza poli(A) (ang. poly(A) polymerase)

Pc

plastocyjanina (ang. plastocyanin)

PCR

reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction)

PEP

fosfoenolopirogronian (ang. phosphoenolpyruvate)

PFK

fosfofruktokinaza (ang. phosphofructokinase)

PH

domena homologii z plekstryną (ang. pleckstrin homology)

Phe

fenyloalanina (ang. phenylalanine)

Pi

wolna grupa fosforanowa (ang. free inorganic phosphate)

pI

punkt izoelektryczny (ang. isoelectric point)

PI3K

3-kinaza-fosfatydyloinozytolu (ang. phosphatidylinositol 3-kinase)

pK

stała dysocjacji (ang. dissociation constant)

PKA

białkowa kinaza A (ang. protein kinase A)

Pol RNA

polimeraza RNA (ang. RNA polymerase)

PPi

grupa pirofosforanowa (ang. inorganic pyrophosphate)

Pro

prolina (ang. proline)

PSI

fotosystem I (ang. photosystem I)

PSII

fotosystem II (ang. photosystem II)

PTB

miejsce wiązania tyrozyny (ang. phosphotyrosine binding)

PTH

pochodna fenylotiohydantoinowa (ang. phenylthiohydantoin)

pz

par zasad (ang. base pair)

RER

szorstkie retikulum endoplazmatyczne (ang. rough endoplasmic reticulum)

RFLP

polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (ang. restriction fragment length polymorphism)

RIP

wewnątrzbłonowa regulowana proteoliza (ang. regulated intramembrane proteolysis)

RNA

kwas rybonukleinowy (ang. ribonucleic acid)

RNAi

interferencja RNA (ang. RNA interference)

RNP

rybonukleoproteina (ang. ribonucleoprotein)

rRNA

rybosomowy RNA (ang. ribosomal RNA)

S

entropia (ang. entropy)

[S]

stężenie substancji (ang. substrate concentration)

SDS

dodecylosiarczan sodu (ang. sodium dodecyl sulfate)

SECIS

sekwencja wprowadzająca selenocysteinę, blok SECIS (ang. selenocysteine insertion sequence)

Se-Cys

selenocysteina (ang. selenocysteine)

Ser

seryna (ang. serine)

SER

gładkie retikulum endoplazmatyczne (ang. smooth endoplasmic reticulum)

SH2

domena homologii 2 z kinazą Src (ang. Src homology 2)

SH3

domena homologii 3 z kinazą Src (ang. Src homology 3)

snoRNA

mały jąderkowy RNA (ang. small nucleolar RNA)

snRNA

mały jądrowy RNA (ang. small nuclear RNA)

SREBP

białko wiążące się ze sterolowym elementem regulatorowym (SRE) (ang. sterol regulatory element binding protein)

SRP

cząstka rozpoznająca sygnał (ang. signal recognition particle)

SSB

białko wiążące jednoniciowy DNA (ang. single-stranded DNA binding protein)

STR

krótkie powtórzenia tandemowe (ang. short tandem repeats)

T

temperatura (ang. temperature)

TBP

białko wiążące kasetę TATA (ang. TATA box binding protein)

TCA

kwas trikarboksylowy (ang. tricarboxylic acid)

TFII

czynnik transkrypcyjny dla polimerazy RNA II (ang. transcription factor for RNA polymerase II)

TFIID

czynnik transkrypcyjny D dla polimerazy RNA II (ang. transcription factor IID)

TFIIIA

czynnik transkrypcyjny A dla polimerazy RNA III (ang. transcription factor IIIA)

TFIIIC

czynnik transkrypcyjny C dla polimerazy RNA III (ang. transcription factor IIIC)

TGF-?

transformujący czynnik wzrostu ? (ang. transforming growth factor ?)

Thr

treonina (ang. threonine)

Tris tris

(hydroksymetylo)aminometan (ang. tris(hydroxymethyl)aminomethane)

tRNA

transportujący RNA (ang. transfer RNA)

Trp

tryptofan (ang. tryptophan)

trp

operon tryptofanowy (ang. tryptophan operon)

Tyr

tyrozyna (ang. tyrosine)

U

jednostka enzymatyczna (ang. enzyme unit)

UBF

czynnik transkrypcyjny wiążący się zarówno z sekwencją UCE, jak i sekwencją występującą obok, nakładającą się na promotor rdzeniowy (ang. upstream binding factor)

UCE

element kontrolny położony przed miejscem startu transkrypcji (ang. upstream control element)

UDP

urydynodifosforan (ang. uridine diphosphate)

UTP

urydynotrifosforan (ang. uridine 5'-triphosphate)

UTR

rejon nieulegający translacji (ang. untranslated region)

UV

ultrafiolet (ang. ultraviolet)

V

objętość (ang. volume)

Val

walina (ang. valine)

VLDL

lipoproteina o bardzo małej gęstości (ang. very low density lipoprotein)

YFP

białko żółtej fluorescencji (ang. yellow fluorescent protein)

A1Komórki prokariotyczne

Powstanie i ewolucja komórek

Mimo olbrzymiej różnorodności systemów ożywionych wszystkie organizmy żyjące na Ziemi są uderzająco jednorodne na poziomie molekularnym, co wskazuje, że pochodzą od wspólnego przodka. Życie pojawiło się przynajmniej 3,8 miliarda lat temu, chociaż to, jak zostało ono zapoczątkowane i jak powstała pierwsza komórka, jest przedmiotem dyskusji. Eksperymentalnie wykazano, że w warunkach, jakie występowały w pierwotnej atmosferze Ziemi, w tak zwanej erze prebiotycznej, cząsteczki prostych związków organicznych mogły powstać, a następnie spontanicznie polimeryzować w makrocząsteczki. Kolejnym krytycznym krokiem było uzyskanie przez makrocząsteczki zdolności do samoreplikacji (autoreplikacji), co można zaobserwować obecnie w przypadku kwasów nukleinowych[1], oraz do katalizowania innych reakcji - wykazano to w przypadku kwasu rybonukleinowego (RNA) (patrz temat G1). Przypuszcza się, że pierwsza komórka powstała w wyniku otoczenia samoreplikującego się RNA błoną zbudowaną z fosfolipidów (patrz temat E1), co oddzieliło wnętrze komórki od otaczającego ją środowiska. Makrocząsteczki otoczone błoną mogły być utrzymywane jako jednostka zdolna do samoreplikacji i podlegająca dalszej ewolucji, co dało początek różnorodności form życia występujących współcześnie na Ziemi. Analiza sekwencji nukleotydowych kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) (patrz temat F1) u różnych organizmów pozwoliła na odtworzenie przypuszczalnej drogi ewolucji od komórki wspólnego przodka do współczesnych komórek i organizmów (rys. 1).

W świecie ożywionym wyróżnia się zatem trzy główne działy czy domeny: bakterie, archeony i eukarionty (patrz temat A2). Bakterie, takie jak Escherichia coli (E. coli) oraz gatunki z rodzaju Bacillus, jak również cyjanobakterie (fotosyntetyzujące niebieskozielone sinice) to prokarionty powszechnie spotykane w glebie, wodzie i żyjące wewnątrz lub na powierzchni innych większych organizmów. Archeony zamieszkują niezwykłe środowiska, jak solanki, kwaśne gorące źródła i głębiny oceanów. Należą do nich bakterie siarkowe i metanogenne (metanogeny), chociaż niektóre występują w mniej "złowrogich" środowiskach.

Prokarionty

Prokarionty są najliczniejszymi i najbardziej rozpowszechnionymi organizmami na Ziemi. Są tak klasyfikowane, ponieważ nie mają jądra komórkowego wydzielonego błoną. Prokarionty obejmują dwie oddzielne, ale spokrewnione ze sobą grupy: bakterie (eubakterie - bakterie właściwe) oraz archeony (archebakterie). Te dwie odrębne grupy prokariontów rozdzieliły się wcześnie w historii życia na Ziemi (rys. 1).

Budowa komórki prokariotycznej

Rozmiary prokariontów mieszczą się zwykle w zakresie od 0,1 do 10 ?m, a ich kształt należy do jednego z trzech podstawowych: kulistego (ziarniaki, cocci), pałeczkowatego (pałeczki, laseczki, bacilli) lub helikalnie skręconego (krętki, spirilla). Komórki prokariotyczne, jak wszystkie komórki, są otoczone błoną komórkową, która całkowicie obejmuje cytozol i oddziela komórkę od otaczającego środowiska (rys. 2). Błona komórkowa, o grubości około 8 nm, składa się z fosfolipidowej dwuwarstwy zawierającej białka (patrz tematy E1 i E2). Prokarionty nie mają otoczonych błoną organelli wewnątrzkomórkowych, tak charakterystycznych dla eukariontów (patrz temat A2). Wodny cytozol zawiera makrocząsteczki [enzymy, informacyjny kwas rybonukleinowy (mRNA), transportujący (transferowy) RNA (tRNA) i rybosomy], związki organiczne i jony niezbędne dla metabolizmu komórkowego. W cytozolu zawarty jest również prokariotyczny 'chromosom' złożony z pojedynczej kolistej cząsteczki DNA, która jest skondensowana w formie ciała określanego jako nukleoid (rys. 2) (patrz temat F2).

Ściany komórek bakteryjnych

Dla ochrony przed mechanicznymi urazami i ciśnieniem osmotycznym większość komórek prokariotycznych jest otoczona sztywną ścianą komórkową o grubości 3-25 nm (rys. 2). Ściana ta jest zbudowana z peptydoglikanu, kompleksu oligosacharydów i białek. Składnik oligosacharydowy zawiera liniowy łańcuch występujących zamiennie N-acetyloglukozaminy (GlcNAc) i kwasu N-acetylomuraminowego (NAM) połączonych wiązaniem ?-1,4-glikozydowym (patrz temat J1). Do grupy kwasu mlekowego w NAM poprzez wiązanie amidowe przyłączony jest tetrapeptyd zawierający D-aminokwasy. Tetrapeptydowe łańcuchy boczne sąsiadujących ze sobą równolegle łańcuchów peptydoglikanu są kowalencyjnie połączone w sieć poprzez inne krótkie peptydy. Intensywne usieciowanie w peptydoglikanowej ścianie komórkowej nadaje jej wytrzymałość i sztywność. Obecność D-aminokwasów w peptydoglikanie zapewnia ścianie komórkowej oporność na działanie proteaz, które działają na bardziej powszechnie występujące L-aminokwasy (patrz temat B1), ale jednocześnie stanowi unikatowe miejsce działania pewnych antybiotyków, takich jak penicylina. Penicylina działa hamująco na enzym, który tworzy kowalencyjne usieciowanie w peptydoglikanie, przez co osłabia ścianę komórkową. Wiązania ?-1,4-glikozydowe pomiędzy NAM i GlcNAc są wrażliwe na hydrolizę katalizowaną przez enzym lizozym, który występuje we łzach, śluzie i innych wydzielinach ciała.

Bakterie mogą być klasyfikowane jako Gram-dodatnie i Gram-ujemne w zależności od tego, czy zabarwiają się metodą Grama. Bakterie Gram-dodatnie (np. Bacillus polymyxa) mają grubą (25 nm) ścianę komórkową otaczającą ich błonę komórkową, natomiast bakterie Gram-ujemne (np. E. coli) mają cieńszą (3 nm) ścianę komórkową i drugą błonę zewnętrzną (rys. 3). W odróżnieniu od błony komórkowej, ta zewnętrzna błona jest wysoce przepuszczalna dla stosunkowo dużych cząsteczek (o masie cząsteczkowej > 1000 Da) dzięki białkom - porynom, które tworzą pory w dwuwarstwie lipidowej (patrz temat E3). Pomiędzy błoną zewnętrzną i ścianą komórkową znajduje się peryplazma, przestrzeń wypełniona białkami wydzielanymi przez komórkę.

Wici bakteryjne

Liczne komórki bakteryjne mają podobne do ogonów przydatki nazywane wiciami. Dzięki ruchom rotacyjnym wici bakterie mogą przemieszczać się w płynie pozakomórkowym albo w kierunku atraktanta, albo oddalają się od repelenta. Ruchy takie określa się terminem chemotaksja. Wici bakteryjne różnią się od rzęsek i wici eukariontów dwiema cechami: 1) każda wić bakteryjna jest zbudowana z białka flageliny (o podjednostce 53 kDa), a nie tubuliny (patrz temat B5); 2) wić wykonuje raczej ruchy rotacyjne (rotacja), a nie falowego zginania. Bakterie E. coli mają około sześciu wici, które powstają w przypadkowych miejscach na powierzchni komórki. Są one cienkimi, helikalnie skręconymi filamentami o średnicy 15 nm i długości 10 ?m. Mikroskopia elektronowa ujawniła, że filament wici zawiera 11 podjednostek ustawionych w dwóch obrotach helikalnych, i - kiedy jest oglądany od końca - wygląda jak 11-łopatkowe śmigło z pustym centralnym rdzeniem. Wici rozrastają się poprzez dodawanie nowych podjednostek flageliny na końcu oddalonym od komórki, przy czym nowe podjednostki dyfundują przez centralny rdzeń. U podstawy wici przy błonie komórkowej znajduje się motor wici, skomplikowany zbiór około 40 białek. Rotacja wici jest napędzana przez przepływ protonów poprzez niektóre z białek motoru. Podobny, napędzany protonami motor został znaleziony w F0F1-ATPazie[2], która katalizuje syntezę adenozynotrifosforanu (ATP) (patrz temat L2).

A2Komórki eukariotyczne

Eukarionty

Do eukariontów zalicza się tak zróżnicowane organizmy, jak: zwierzęta, rośliny, grzyby i śluzowce. U wszystkich eukariontów komórkę otacza błona komórkowa, mają one otoczone błoną jądro komórkowe i zawierają liczne różne organelle komórkowe (rys. 1). Organelle są strukturami otoczonymi błoną i każde wypełnia określoną funkcję oraz zawiera specyficzny komplet białek i innych cząsteczek. Kluczowe różnice między komórkami eukariotycznymi i prokariotycznymi (patrz temat A1) zestawiono w tabeli 1. Komórki zwierząt i roślin mają zasadniczo tę samą budowę, chociaż niektóre organelle i struktury są znajdywane w jednych komórkach, natomiast w innych ich nie ma (np. chloroplasty, wakuole i ściana komórkowa w komórkach roślin, lizosomy w komórkach zwierząt).

Tabela 1. Kluczowe różnice pomiędzy komórką eukariotyczną i prokariotyczną

Cecha charakterystyki

Prokarionty

Eukarionty

Średnica

Ok. 1 ?m

10-100 ?m

Jądro komórkowe

Brak

Obecne

Organelle cytoplazmatyczne

Brak

Obecne

Zawartość DNA (pary zasad)*

1 × 106 do 5 × 106

1,5 × 107 do 5 × 109

Chromosomy

Pojedyncza kolista cząsteczka DNA

Liczne liniowe cząsteczki DNA

* Znane są genomy bakteryjne większe od genomów organizmów eukariotycznych, poza tym liczba 5 × 109 nie określa górnego limitu wielkości genomów organizmów eukariotycznych (przyp. tłum.).

Błona komórkowa

Błona komórkowa otacza komórkę, oddzielając ją od otoczenia i utrzymując w cytozolu właściwy skład jonowy i ciśnienie osmotyczne. Błona komórkowa, jak wszystkie błony w komórce, jest selektywnie przepuszczalna dla pewnych cząsteczek na skutek obecności określonych białek w błonie (patrz temat E3). Błona komórkowa uczestniczy również w komunikowaniu się z innymi komórkami, na przykład poprzez wiązanie ligandów (małych cząsteczek, takich jak hormony, neuroprzekaźniki i inne) do białek receptorowych na jej powierzchni (patrz temat E5). Błona komórkowa uczestniczy także w egzocytozie (sekrecji) i endocytozie (internalizacji) białek oraz innych makrocząsteczek (patrz temat E4).

Jądro komórkowe

Jądro komórkowe otoczone jest dwiema błonami, wewnętrzną i zewnętrzną błoną jądrową (otoczką jądrową). Te dwie błony łączą się ze sobą w obrębie porów jądrowych, poprzez które cząsteczki (mRNA, białka, podjednostki rybosomów i inne) mogą się poruszać między jądrem komórkowym a cytozolem. Inne białka, na przykład te zaangażowane w regulację ekspresji genów, mogą przechodzić przez pory z cytozolu do jądra komórkowego. Zewnętrzna błona otoczki jądrowej często łączy się z szorstkim retikulum endoplazmatycznym (RER). W obrębie jądra komórkowego DNA jest ciasno zawinięty wokół białek histonowych (histonów) i zorganizowany w kompleksy nazywane chromosomami (patrz temat F2). W mikroskopie świetlnym widoczne jest jąderko (patrz temat A4), podobszar jądra komórkowego, który jest miejscem syntezy rybosomowego kwasu rybonukleinowego (rRNA).

Retikulum endoplazmatyczne

Retikulum endoplazmatyczne (ang. endoplasmic reticulum, ER) to połączona sieć pęcherzyków błonowych. Szorstkie (ang. rough) retikulum endoplazmatyczne (RER) zawiera na powierzchni od strony cytozolu rybosomy. Jest to miejsce biosyntezy białek błonowych i sekrecyjnych (wydzielniczych) (patrz temat H4). W świetle RER znajdują się enzymy biorące udział w modyfikacji potranslacyjnej białek (glikozylacja, proteoliza i inne) błonowych i sekrecyjnych (patrz temat H5). Gładkie (ang. smooth) retikulum endoplazmatyczne (SER), na którym nie są osadzone rybosomy, jest miejscem biosyntezy fosfolipidów. Zachodzą w nim liczne reakcje detoksykacyjne.

Aparat Golgiego

Aparat Golgiego jest systemem spłaszczonych woreczków błonowych. Pęcherzyki oddzielane z RER, zawierające białka błonowe i wydzielnicze, ulegają fuzji z aparatem Golgiego od jego strony (przedziału) cis i przekazują do niego swoją zawartość. W czasie przejścia przez aparat Golgiego dochodzi do dalszych modyfikacji potranslacyjnych białek, a następnie są one sortowane i pakowane do różnych pęcherzyków (patrz temat H5). Pęcherzyki te odpączkowują od strony (przedziału) trans aparatu Golgiego (tzw. sieci trans aparatu Golgiego), są transportowane przez cytozol i ostatecznie ulegają fuzji albo z błoną komórkową, aby wydzielić zawartość do przestrzeni pozakomórkowej (w procesie znanym jako egzocytoza; patrz temat E4), albo z innymi organellami (np. lizosomami) (patrz temat H4).

Mitochondria

Mitochondrium otacza wewnętrzna i zewnętrzna błona mitochondrialna, pomiędzy którymi znajduje się przestrzeń międzybłonowa (rys. 2a). Zewnętrzna błona zawiera białka poryny, które zapewniają jej przepuszczalność dla cząsteczek o masie do 10 kDa. Wewnętrzna błona, która jest znacznie mniej przepuszczalna, tworzy duże wpuklenia zwane grzebieniami, które wnikają do znajdującej się wewnątrz macierzy. Wewnętrzna błona mitochondrialna jest miejscem fosforylacji oksydacyjnej i transportu elektronów biorących udział w syntezie ATP (patrz temat L2). W macierzy mitochondrialnej zachodzą liczne reakcje metaboliczne obejmujące cykl kwasu cytrynowego (patrz temat L2) i rozkład kwasów tłuszczowych (patrz temat K2). W macierzy zawarty jest też mitochondrialny DNA, który koduje niektóre z białek mitochondrialnych.

Chloroplasty

Chloroplasty, obecne wyłącznie w komórkach roślinnych, również mają błonę wewnętrzną i zewnętrzną[5]. Dodatkowo występuje w nich rozbudowany system wewnętrznych błon budowanych przez tylakoidy (połączone spłaszczone pęcherzyki tworzące dyski). Ułożone jeden na drugim tylakoidy tworzą grana (rys. 2b). W pęcherzykach tylakoidów znajduje się zielony barwnik chlorofil (patrz temat M4), razem z enzymami, które wyłapują energię świetlną i przekształcają w energię chemiczną w formie ATP (patrz temat L3). Stroma, przestrzeń otaczająca tylakoidy, jest miejscem asymilacji dwutlenku węgla - przemiany CO2 w związki organiczne. Chloroplasty, podobnie jak mitochondria, zawierają DNA, który koduje niektóre z białek chloroplastów.

Lizosomy

Lizosomy, występujące tylko w komórkach zwierzęcych, mają pojedynczą błonę graniczną. Wnętrze tych organelli cechuje lekko kwasowy odczyn (pH 4-5), utrzymywany przez integralne białka błonowe, które pompują jony H+ do ich wnętrza (patrz temat E3). Lizosomy zawierają zestaw hydrolaz, które są optymalnie aktywne w tym kwasowym pH (i dlatego nazywane są kwaśnymi hydrolazami), a stają się nieaktywne w obojętnym pH cytozolu i płynu zewnątrzkomórkowego. Enzymy te uczestniczą w degradacji własnych i obcych makrocząsteczek do ich monomerycznych podjednostek; proteazy degradują białka, lipazy degradują lipidy, fosfatazy usuwają reszty fosforanowe z nukleotydów i fosfolipidów, a nukleazy degradują DNA i RNA. Lizosomy uczestniczą w degradacji pozakomórkowych makrocząsteczek, które są wchłaniane do komórki na drodze endocytozy (patrz temat E4), jak również w degradacji i recyklingu normalnie starzejących się organelli komórkowych w procesie zwanym autofagią.

Peroksysomy

Organelle te mają pojedynczą błonę graniczną i zawierają enzymy, które degradują kwasy tłuszczowe i aminokwasy. Produktem ubocznym tych reakcji jest nadtlenek wodoru, który działa toksycznie na komórki. Dzięki obecności w peroksysomach dużych ilości enzymu katalazy toksyczny nadtlenek wodoru zostaje szybko przekształcony w nieszkodliwe H2O i O2.

Cytozol

Cytozol jest częścią cytoplazmy, która nie jest zawarta w żadnej z organelli wewnątrzkomórkowych i stanowi główne miejsce metabolizmu komórkowego. Zawiera dużą liczbę różnych enzymów i innych białek. Na przykład w cytozolu mają miejsce reakcje glikolizy (patrz temat J3), glukoneogenezy (patrz temat J4), szlaku pentozofosforanowego (patrz temat J5) i syntezy kwasów tłuszczowych (patrz temat K3). Cytozol nie jest homogennym płynem, jest w nim zawarty cytoszkielet. W cytozolu wielu komórek występują ciałka inkluzyjne (agregaty materiału, który nie jest otoczony błoną), takie jak granule glikogenu w komórkach wątroby i mięśni oraz kropelki triacyloglicerolu w komórkach tkanki tłuszczowej.

Cytoszkielet

Cytoszkielet jest wewnątrzkomórkowym rusztowaniem ważnym dla utrzymywania lub zmieniania kształtu komórki, które umożliwia takim komórkom jak plemniki i białe krwinki (leukocyty) przemieszczanie się z jednego miejsca w drugie, transport wewnątrzkomórkowych pęcherzyków oraz rozdzielanie chromosomów w czasie mitozy, a następnie podział komórki na dwie. Cytoszkielet tworzą trzy rodzaje filamentów: mikrofilamenty, filamenty pośrednie i mikrotubule, o odmiennych właściwościach mechanicznych i dynamice.

Mikrofilamenty

Mikrofilamenty (nazywane też filamentami aktynowymi), o średnicy 5-9 nm, pełnią funkcję mechanicznego wspomagania i decydują o kształcie powierzchni komórki oraz uczestniczą w ruchu całej komórki. Mikrofilamenty są dwuniciowymi helikalnie skręconymi polimerami białka aktyny, które tworzą elastyczne struktury zorganizowane w różnorodne liniowe wiązki i bardziej rozbudowane sieci. W wyniku oddziaływania z miozyną, mikrofilamenty tworzą kurczliwe zespoły, które biorą udział w różnych ruchach wewnątrzkomórkowych, umożliwiających przepływ cytoplazmatyczny i tworzenie wgłębień błony (patrz temat B5).

Filamenty pośrednie

Filamenty pośrednie (o średnicy 7-11 nm) zapewniają mechaniczną wytrzymałość i oporność na ściskanie. Budowane są przez białka filamentów pośrednich, które tworzą dużą, heterogenną rodzinę białek, budujących struktury przypominające linę. Skóra wyższych zwierząt zawiera rozbudowaną sieć filamentów pośrednich budowanych przez białko keratynę, o dwuniciowej helisie powstałej po skręceniu dwóch helis ? (tzw. superhelisa), podczas gdy blaszka jądrowa, siatka tuż pod wewnętrzną błoną jądra komórkowego, jest utworzona z innego rodzaju filamentów pośrednich.

Mikrotubule

Mikrotubule, trzeci rodzaj filamentów cytoszkieletu, określają położenie organelli otoczonych błonami i kierują ich wewnątrzkomórkowym transportem. Na przykład wrzeciono mitotyczne uczestniczące w rozdzielaniu podwojonych w wyniku replikacji chromosomów w czasie mitozy jest zbudowane z mikrotubul. Mikrotubule to struktury o kształcie pustego w środku cylindra, którego zewnętrzna średnica wynosi 25 nm. Zbudowane są z białka tubuliny (rys. 3). Ściana tego cylindra to helikalna struktura powstająca w wyniku naprzemiennego ułożenia podjednostek w postaci ?- i ?-tubuliny, o masie 50 kDa każda. Na przekroju mikrotubuli widać, że na jeden skręt filamentu przypada 13 podjednostek. Mikrotubule w komórkach powstają poprzez dodawanie kolejnych cząsteczek ?- i ?-tubuliny do już istniejących filamentów lub centrów nukleacji. Jeden z końców mikrotubuli jest zwykle przyczepiony do centrum organizacji mikrotubul noszącego nazwę centrosom. Związki takie jak kolchicyna i winblastyna hamują polimeryzację mikrotubul, dlatego blokują takie komórkowe procesy jak podział komórki, który zależy funkcjonowanie od mikrotubul. Inny związek paklitaksel stabilizuje tubulinę w mikrotubulach i sprzyja polimeryzacji. Niektóre z tych związków, takie jak winblastyna i paklitaksel, są stosowane jako leki przeciwnowotworowe, ponieważ blokują proliferację szybko dzielących się komórek poprzez zakłócanie organizacji wrzeciona podziałowego.

Ściana komórkowa roślin

Błona komórkowa komórki roślinnej otoczona jest przez ścianę komórkową, która nadaje komórce wytrzymałość i sztywność. Jest ona zbudowana przede wszystkim z celulozy, podobnego do pręta polisacharydu utworzonego z powtarzających się jednostek glukozy połączonych wiązaniem ?-1,4-glikozydowym (patrz temat J2). Cząsteczki celulozy agregują ze sobą za pośrednictwem wiązań wodorowych w wiązki włókien, a z kolei te włókna są sieciowane ze sobą przy udziale innych polisacharydów. W drewnie dodatkową wytrzymałość i sztywność zapewnia ścianom komórkowym lignina. Jest to nierozpuszczalny w wodzie polimer złożony z alkoholi aromatycznych.

Wakuola komórki roślinnej

W komórkach roślinnych zwykle występują jedna lub więcej ograniczonych błoną wakuoli. Są one miejscem przechowywania zapasowych substancji odżywczych (np. sacharozy), wody, jonów oraz produktów odpadowych (w szczególności nadmiarowych związków zawierających azot). Podobnie jak lizosomy w komórkach zwierząt, wakuole mają kwasowe pH utrzymywane przez pompy H+ w błonie, a także zawierają rozmaite enzymy degradujące. Napływ wody do wakuoli powoduje jej rozszerzanie się, wytwarzające ciśnienie hydrostatyczne wewnątrz komórki (turgor), które jest równoważone przez mechaniczną wytrzymałość ściany komórkowej.

Przypisy

[1] Kwasy nukleinowe we współczesnych komórkach nie ulegają autoreplikacji - zachodzi u nich replikacja z udziałem innych cząsteczek (przyp. tłum.).

[2] Obecnie preferuje się nazwę syntaza ATP (przyp. tłum.).

[3] Obecnie określane jako kanały VDAC (ang. voltage-dependent anion channels, zależne od potencjału kanały o selektywności anionowej) (przyp. tłum.).

[4] Polimer złożony z alkoholi aromatycznych (przyp. tłum.).

[5] Wśród chloroplastów występujących u różnych organizmów (nie tylko u roślin) są takie, które mają trzy lub cztery błony oddzielające chloroplast od cytoplazmy. U niektórych roślinopodobnych protistów (np. Stramenopiles, Cercozoa) chloroplast otaczają 4 błony, u innych (Euglenozoa, Dinoflagellata) są 3 błony. Autorzy podręcznika pomijają teorię seryjnych endosymbioz, która tłumaczy ewolucyjne powstanie mitochondriów i chloroplastów (także tych o większej liczbie błon) (przyp. tłum.).

[6] W fazie M, która trwa około jednej godziny, zachodzi podział komórki obejmujący mitozę (podział jądra komórkowego) i cytokinezę (podział cytoplazmy) (przyp. tłum.).

[7] Jerzy Nomarski (1919-1997) był polskim fizykiem pracującym w uczelniach francuskich. Rozwinął technikę mikroskopii interferencyjnej poprzez wprowadzenie techniki kontrastu interferencyjno-różniczkowego, określanego na jego cześć mianem mikroskopii z kontrastem Nomarskiego (przyp. tłum.).

[8] Możliwością zmiany układu przestrzennego atomów w cząsteczce (przyp. red.).

[9] Tyrozyna zawiera grupę hydroksylową przyłączoną do hydrofobowego łańcucha bocznego, dlatego w innych opracowaniach [np. Berg, J.M., Stryer, L., Tymoczko, J.L., Gatto, G.J. (2018) Biochemia, Wyd. 5. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa] zaliczana jest do aminokwasów polarnych pozbawionych ładunku (przyp. red.).

[10] Masa molowa wyrażana w g/mol (przyp. red.).

[11] Przyjmuje się również pisownię: chaperony (przyp. red.).

[12] Struktura taka powstaje także przy udziale struktur ? powstających w obrębie tego samego łańcucha polipeptydowego (przyp. red.).

[13] Promieniowanie elektromagnetyczne o częstotliwości z zakresu radiowego (60-900 MHz) (przyp. red.).