Autorzy
Dr n. przyr. Zbigniew Bartoszewicz
Laboratorium Naukowe
Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych i Endokrynologii
Warszawski Uniwersytet Medyczny
Dr hab. n. biol. Jacek Golański
Zakład Zaburzeń Krzepnięcia Krwi
Katedra Nauk Biomedycznych
Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Dr n. biol. Maria Kapusta
Zakład Diagnostyki
Katedra Biochemii Klinicznej
Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum w Krakowie
Dr n. biol. Agnieszka Kondracka
Laboratorium Naukowe
Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych i Endokrynologii
Warszawski Uniwersytet Medyczny
Mgr Barbara Kopeć
Diagnostyka sp. z o. o. w Krakowie
Prof. dr hab. n. med. Bogdan Mazur
Katedra i Zakład Mikrobiologii i Immunologii
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Dr n. med. Anna Raszeja-Specht, docent
Zakład Medycyny Laboratoryjnej
Katedra Biochemii Klinicznej
Gdański Uniwersytet Medyczny
Prof. dr hab. n. med. Marek Sanak
Zakład Biologii Molekularnej i Genetyki Klinicznej
II Katedra Chorób Wewnętrznych
Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum w Krakowie
Dr n. med. Łukasz Sędek
Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii Dziecięcej
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Mgr inż. Piotr Sitkowski
Eclipse sp. z o. o. w Krakowie
Dr hab. n. med. Bogdan Solnica, prof. UJ
Katedra Biochemii Klinicznej
Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum w Krakowie
Dr n. med. Elżbieta Stefaniuk
Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej
Narodowy Instytut Leków w Warszawie
Prof. dr hab. n. med. Krystyna Sztefko
Zakład Biochemii Klinicznej
Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii
Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum w Krakowie
Dr hab. n. med. Przemysław Tomasik
Zakład Biochemii Klinicznej
Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii
Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum w Krakowie
1
Charakterystyka analityczna metody laboratoryjnej
Bogdan Solnica
1.1. Wstęp
Charakterystyka analityczna obejmuje wiele cech metody laboratoryjnej decydujących o możliwości zastosowania jej do określonych celów, np. w diagnostyce, w praktyce klinicznej. Dlatego charakterystyka analityczna metod stosowanych w medycznej diagnostyce laboratoryjnej cechuje się pewnymi odrębnościami. Składają się na nią cechy metody opisywane przez parametry, wyznaczane w toku wystandaryzowanych procedur przez producentów odczynników i sprzętu oraz w medycznych laboratoriach diagnostycznych (walidacja metod). Ogólnie, charakterystyka analityczna określa, czy metoda daje wystarczająco dokładne i powtarzalne wyniki oznaczeń w niezbędnym z punktu widzenia ich zastosowania zakresie badanej cechy analitu.
Na charakterystykę analityczną metody składają się:
granica próbki ślepej, granica wykrywalności, granica oznaczalności, czułość funkcjonalna, liniowość, zakres oznaczalności, odporność, dokładność, precyzja.
1.2. Granica próbki ślepej
Granica próbki ślepej (limit of blank - LoB) określa granicę szumu analitycznego - jest największym wynikiem pomiaru, jaki z określonym prawdopodobieństwem można uzyskać w materiale niezawierającym oznaczanego analitu. Jest ona wyznaczana na podstawie wyników serii pomiarów, zwykle 20, w materiale niezawierającym oznaczanego analitu (np. kalibrator zerowy). Wartość średnia uzyskanych wyników odpowiada zerowemu stężeniu oznaczanej substancji (ryc. 1.1). Gdy jest ona różna od zera, wskazuje to na obciążenie analityczne (błąd systematyczny; bias) metody. Granica próbki ślepej odpowiada 95. centylowi rozkładu wyników oznaczeń w próbkach niezawierających analitu (ślepych) i jest obliczana na podstawie wartości średniej i odchylenia standardowego (SDblank) tego rozkładu według wzoru:
LoB = średnia + 1,645 × SDblank
Rycina 1.1
Rozkład wyników oznaczeń w materiale niezawierającym analitu i w materiale zawierającym analit w bardzo małym stężeniu. Przy stężeniu analitu równym granicy wykrywalności (LoD) 5% uzyskanych wyników będzie poniżej granicy próbki ślepej (LoB).
1.3. Granica wykrywalności
Granica wykrywalności (limit of detection - LoD) to najmniejsze stężenie, które może być odróżniane od granicy szumu analitycznego i przy którym możliwe jest wiarygodne wykrycie analitu. Granicę tę wyznacza się, wykonując serie oznaczeń (20-60) w kilku próbkach zawierających oznaczaną substancję w stężeniu bliskim granicy próbki ślepej. Dla każdej próbki oblicza się średnią i odchylenie standardowe (SD) wyników serii oznaczeń.
Granicę wykrywalności oblicza się z wykorzystaniem granicy próbki ślepej według wzoru:
LoD = LoB + 1,645 × SD
Granica wykrywalności jest większa od granicy próbki ślepej o (1,645 × SD), co oznacza, że obecny w materiale analit wywołuje sygnał trwale silniejszy niż w przypadku granicy próbki ślepej, ale przy stężeniu analitu na poziomie granicy wykrywalności 5% uzyskanych wyników będzie poniżej granicy próbki ślepej (patrz ryc. 1.1). Innymi słowy, granica wykrywalności jest małym stężeniem (lub inną cechą) analitu, przy którym 95% wyników pomiaru przekracza granicę próbki ślepej, co z kolei oznacza, że w 5% próbek metoda nie wykryje analitu o tym stężeniu.
1.4. Granica oznaczalności
Granica oznaczalności (limit of quantitation - LoQ) jest najmniejszym stężeniem substancji, które może być oznaczane z całkowitym błędem analitycznym spełniającym kryteria dokładności wymagane do celów klinicznych. W przeciwieństwie do granicy próbki ślepej i granicy wykrywalności, wyznaczanych wyłącznie na podstawie danych analitycznych, granica oznaczalności jest ponadto określana przez dokładność i precyzję wymagane do klinicznego zastosowania metody.
Całkowity błąd analityczny (total analytical error - TAE) jest obliczany według wzoru:
TAE = bias + 2 × SD
gdzie odchylenie standardowe (SD) wyników oznaczeń w 40 próbkach tego samego materiału jest miarą precyzji metody.
Granica oznaczalności nie może być mniejsza od granicy wykrywalności, te dwie wartości są sobie równe, gdy całkowity błąd analityczny wyznaczony dla stężenia analitu na poziomie granicy wykrywalności ma wartość dopuszczalną. W przeciwnym razie granica oznaczalności przekracza granicę wykrywalności i musi być określona przez wyznaczenie całkowitego błędu analitycznego dla stężeń większych od granicy wykrywalności (ryc. 1.2).
Rycina 1.2
Rozkład wyników oznaczeń w materiale niezawierającym analitu, w materiale zawierającym analit w stężeniu na poziomie granicy wykrywalności i w nieco większym stężeniu. Współzależności między granicą: próbki ślepej (LoB), wykrywalności (LoD) i oznaczalności (LoQ).
1.5. Czułość funkcjonalna
Czułość funkcjonalna jest definiowana jako stężenie analitu oznaczane z określoną nieprecyzyjnością - przy współczynniku zmienności (CV) równym 20% (lub 10%). Warto zaznaczyć, że definicja czułości funkcjonalnej nie uwzględnia obciążenia analitycznego. Podobnie jak w przypadku granicy oznaczalności czułość funkcjonalna charakteryzuje metodę w kontekście dopuszczalnej zmienności analitycznej (w tym przypadku - nieprecyzyjności).
1.6. Liniowość
Liniowość to przedział badanej cechy (np. stężenia) analitu, w którym występuje korelacja (R = 0,999) między tą wartością a sygnałem analitycznym. Zakres liniowości zbliżony jest do zakresu oznaczalności - przedziału cechy analitu, w obrębie którego jest ona oznaczana z wymaganą dokładnością, precyzją i liniowością. Nachylenie prostej odzwierciedlającej zależność cecha (stężenie)-sygnał jest miarą czułości analitycznej, czyli zdolności metody/układu pomiarowego do adekwatnej reakcji na zmiany cechy analitu (ryc. 1.3).
Rycina 1.3
Zakres liniowości i oznaczalności metody analitycznej.
1.7. Odporność
Odporność (robustness; tolerancyjność) metody laboratoryjnej określa, w jakiej mierze wyniki oznaczeń zależą od niewielkich przypadkowych zmian warunków ich wykonywania (sposobu opracowania próbki, zmian temperatury, wilgotności, zasilania aparatury i in.).
