Krótka historia mikrobiologii przemysłowej
1.1. Wprowadzenie
Początki mikrobiologii przemysłowej sięgają ponad 200 lat wstecz. W tym czasie następował rozwój tej dziedziny - od tajemniczych koncepcji po racjonalną naukę i technologię, z ogromnymi osiągnięciami społecznymi i medycznymi oraz wpływem komercyjnym. Mikrobiologia przemysłowa to komercyjna eksploatacja mikroorganizmów celem uzyskania różnych, ważnych dla człowieka produktów. Produkty mikrobiologiczne mają bezpośredni lub pośredni wpływ na wskaźniki ekonomiczne, środowiskowe oraz socjalne w społeczeństwach. Już od zarania cywilizacji mikroorganizmy wykorzystywano w produkcji przemysłowej wyrobów alkoholowych oraz przetworów mlecznych. Pierwsze badania dotyczące roli mikroorganizmów w procesach fermentacji prowadził Ludwik Pasteur w latach pięćdziesiątych XIX w. Badania te przyczyniły się do rozwoju metod pozyskiwania czystych szczepów i wykorzystywania ich do prowadzenia fermentacji.
W latach 30. ubiegłego wieku przypadkowe odkrycie penicyliny przez Alexandra Fleminga spowodowało wzrost znaczenia mikrobiologii przemysłowej w oczach ludzkości. Związek istotnych przemysłowo metabolitów z mikroorganizmami zrewolucjonizował przemysł do poszukiwania nowych mikroorganizmów, które produkują różnego rodzaju antybiotyki, enzymy, substancje antyrakowe itp. W związku z rozwojem biochemii, techniki ich izolacji i oczyszczania znacznie podniosły jakość pożądanych metabolitów. Lata 70. ubiegłego wieku to początek ery klonowania genów, które, jak się okazuje, jest bardzo ważne w pozyskiwaniu ulepszonych szczepów produkcyjnych. Techniki takie jak bezpośrednia mutageneza genomowego DNA, umożliwiają permanentne zmiany w genomach szczepów przemysłowych. Połączenie mikrobiologii, inżynierii biochemicznej i biologii molekularnej dało podstawy biotechnologii - nowej dyscyplinie naukowej, która kontynuuje zdobycze tych poprzednich. Dywersyfikacja powstała poprzez tworzenie subdyscyplin, takich jak genomika, transkryptomika, proteomika, analiza strumienia metabolicznego z analizą ilościową złożonych metabolitów, a inżynieria biochemiczna połączyła się w inżynierię biosystemów. W ostatniej dekadzie nastąpiło ponowne zrewolucjonizowanie mikrobiologii przemysłowej dzięki zastosowaniu systemu macierzy oraz bioinformatyki.
1.2. Ery rozwoju mikrobiologii przemysłowej
Częściowo kryterium podziału mikrobiologii przemysłowej na ery rozwoju są produkty, które pojawiały się w danym czasie, zwykle po raz pierwszy. Na ogół nowa fermentacja lub jej produkt nie pojawiały się od razu w doskonałej formie, lecz wymagały dalszych prac badawczych i rozwojowych. W zasadzie większość fermentacji przemysłowych jest wciąż udoskonalana, poszukuje się wciąż nowych szczepów, poddaje procesom ulepszania za pomocą różnych narzędzi biologii molekularnej, atrakcyjnych z biotechnologicznego punktu widzenia.
1.2.1. Era przedpasteurowska (przed 1865 r.)
Przed odkryciem Pasteura metodą fermentacji produkowano wyroby alkoholowe (piwo, wino), nabiał (sery, jogurt) oraz takie wyroby, jak ocet winny, nie znając ich mechanizmu. Produkcja wina, piwa i chleba była znana już u Sumerów 6000 lat temu, a w takich krajach jak Mezopotamia i Egipt stała się głównym źródłem dochodów podatkowych. Fermentację soi w Chinach prowadzono już 3500 lat przed naszą erą. Nawet obserwacje mikroskopowe "małych zwierzątek" prowadzone przez Leeuwenhoeka (lata 60. XIX w.) nie były kojarzone z faktem, że przyczyną fermentacji są mikroorganizmy. Dopiero w latach 1837-1848 Schwann i Latour niezależnie wykazali obecność drożdży w procesie fermentacji. Z ich obserwacji wynikało, że drożdże piwne są małymi kulistymi organizmami, zdolnymi do reprodukcji, ale nie stwierdzili, czy drożdże prowadzą proces fermentacji. Krążyły równolegle dwie teorie, że fermentacja wciąż jest konsekwencją "tajnej siły życiowej" albo procesem prowadzonym przez "siły chemiczne".
1.2.2. Era Pasteura (lata 1850-1890)
Ludwik Pasteur ostatecznie odkrył tajemnicę fermentacji. W latach 50. XIX w. codziennie odwiedzał on fabrykę produkującą alkohol i pobierał próbki płynu fermentacyjnego do analizy w swoim laboratorium. W próbkach z produkcji alkoholu znajdował drożdże pączkujące, a w próbkach pobranych z fermentacji kwaśnej (zepsute wino) laseczki fermentujące, które produkowały kwas mlekowy, nadający nieprzyjemny smak wina. Pasteur szczegółowo zbadał fermentację kwasu mlekowego i opracował podstawy procesów fermentacyjnych oraz metody izolacji pojedynczych mikroorganizmów z hodowli w postaci czystych szczepów. W dyskusji wyników swoich badań Pasteur opisał:
1) biologiczną koncepcję fermentacji jako wynik aktywności żywych mikroorganizmów; 2) zasady szczepienia mikroorganizmami w celu rozpoczęcia niezawodnej fermentacji, która była również powszechną praktyką w fermentacji piwa; 3) pojęcie swoistości, zgodnie z którym każdą fermentację można przypisać do określonego mikroorganizmu; 4) niezbędne czynniki, które muszą być dostarczone mikroorganizmom w pożywce fermentacyjnej; 5) specyficzne cechy chemiczne charakteryzujące główne produkty fermentacji.
W ten sposób Pasteur położył podwaliny pod nową dyscyplinę naukową, mikrobiologię, zwaną wówczas bakteriologią. Od tego czasu (koniec XIX w.) przemysł fermentacyjny szybko się rozwijał. Obejmował produkcję piwa i wina, alkoholu przemysłowego, drożdży, kwasu octowego i mlekowego, sera, sosu sojowego i sake. Produkcja piwa stanowiła jedną z najważniejszych działalności gospodarczych. Od tej pory także produkcja wina nabrała dużego znaczenia ekonomicznego, gdyż było ono smaczne, wolne od nadmiaru kwasu octowego i mlekowego. Rozpoczęła się fala powstawania fundacji i instytutów badawczych, głównie rządowych, zajmujących się badaniami nad produkcją piwa, wina i żywności, wody, a także higieną i opieką medyczną, oraz laboratoriów w przemyśle piwowarskim i piekarniczym, w Europie (Monachium, Berlin, Hohenhein, Paryż, Birmingham, Kopenhaga) oraz w USA (Uniwersytety: MIT, Cornell i Wisconsin).
1.2.3. Era rozwoju biochemii i nowych produktów (lata 1890-1940)
W tym czasie opracowano nowe technologie fermentacji przemysłowej produkcji etanolu, butanolu, acetonu i glicerolu, a także kilku kwasów organicznych: octowego, cytrynowego oraz mlekowego. Miały też miejsce badania struktury przestrzennej związków chemicznych, takich jak białka, cukry i tłuszcze, oraz badania dotyczące enzymów. I tak stwierdzono, że ekstrakt drożdżowy powstały na skutek dezintegracji komórek drożdży prowadzi proces fermentacji alkoholowej, w wyniku którego powstaje alkohol i ditlenek węgla. A ściślej, że proces ten prowadzą enzymy uwolnione z komórek. Odkrycie fermentacji wolnej od komórek, w okresie do 1930 r., stymulowało molekularne podejście do badania procesu fermentacji alkoholowej, głównie badań nad kolejnymi półproduktami metabolizmu. Wynikiem tych badań były opracowane ścieżki przebiegu procesu glikolizy prowadzonej przez różne mikroorganizmy, w tym wykrycie produktów pośrednich, takich jak kwasy: pirogronowy, octowy, bursztynowy. W tym czasie również pracowano nad innymi rodzajami fermentacji z produkcją acetonu i wyższych alkoholi, w tym butanolu, który po przekształceniu w butadien i jego polimeryzacji tworzył kauczuk syntetyczny. W okresie I wojny światowej proces fermentacji "aceton-butanol" wykorzystano do produkcji materiałów wybuchowych przy użyciu mikroorganizmów oraz surowców naturalnych (kukurydzy) jako podłoża fermentacyjnego. W czasie I wojny światowej produkowano duże ilości acetonu (w Anglii oraz Kanadzie) oraz glicerolu (w Niemczech). Równolegle podjęto prace nad mikrobiologiczną produkcją kwasów szczawiowego i cytrynowego przez gatunki Penicillium sp. i Aspergillus niger. Kolejnymi produktami wytwarzanymi na drodze fermentacji były kwas glukonowy i kwas mlekowy. Innym ważnym przykładem przemysłowej działalności badawczej było opracowanie technologii utleniania sorbitolu przez szczep Acetobacter jako związku pośredniego do produkcji witaminy C. Z kolei w latach 30. XX w. rozpoczęto wytwarzanie środka farmaceutycznego - L-efedryny -metodą fermentacji cukru przez drożdże w obecności benzaldehydu. Etanol nadal stanowił główny produkt o wyjątkowym znaczeniu gospodarczym.
Równolegle rozwijała się technologia enzymatyczna. Wiele enzymów, w tym diastazę (enzym amylolityczny), proteazy i pektynazy, wyizolowano z różnych organizmów do zastosowań komercyjnych, głównie z Bacillus subtilis oraz Aspergillus oryzae i Aspergillus niger. Już w 1894 r. Takamine uzyskał patent na produkcję preparatu enzymatycznego takadiastazy stosowanego do produkcji amylazy używanej do hydrolizy skrobi w produkcji żywności.
Przypadkowe wydarzenie w londyńskim laboratorium w 1928 r. zmieniło bieg medycyny. Alexander Fleming, bakteriolog ze szpitala St. Mary's, po powrocie z wakacji, podczas rozmowy z kolegą zauważył na płytce agarowej strefę wokół inwazji grzyba, w której bakterie nie rosły. Stwierdził on, że grzyb Penicillium notatum hamuje rozwój chorobotwórczej bakterii Staphylococcus aureus. Wykazał, że substancja antybakteryjna powstaje w hodowli Penicillium i nazwał ją penicyliną. Stwierdził, że penicylina ma działanie antybakteryjne wobec gronkowca i innych patogenów Gram-dodatnich. Fleming opublikował swoje odkrycia w 1929 r. Oczyszczenie niestabilnego związku z ekstraktu grzyba okazało się jednak poza jego możliwościami. Przez dekadę nie poczyniono postępów w wyodrębnianiu penicyliny jako związku leczniczego. W tym czasie Fleming wysyłał swoją pleśń Penicillium każdemu, kto o nią poprosił, w nadziei, że ktoś może wyizolować z hodowli penicylinę do użytku klinicznego.
1.2.4. Era antybiotyków (lata 1940-1960)
W tym okresie opracowano i wdrożono w skali przemysłowej produkcję antybiotyków, w tym penicyliny i streptomycyny, oraz opracowano warunki transformacji i prowadzono transformacje steroidów przy udziale mikroorganizmów (kortyzonu, testosteronu, estrogenu).
Na Uniwersytecie w Oxfordzie, Ernst Chain znalazł artykuł Fleminga z 1929 r. na temat penicyliny i zaproponował swojemu przełożonemu, Howardowi Floreyowi, że spróbuje wyizolować penicylinę. Poprzednik Floreya, George Dreyer, napisał do Fleminga wcześniej list z prośbą o przesłanie próbki szczepu Penicillium, W 1939 r. Howard Florey zebrał zespół, w tym eksperta od grzybów, Normana Heatleya, który pracował nad hodowlą Penicillium spp. i Ernsta Chaina, który z powodzeniem oczyszczał penicylinę z ekstraktu. Florey nadzorował eksperymenty na zwierzętach. 25 maja 1939 r. grupa badaczy wstrzyknęła ośmiu myszom zjadliwy szczep Streptococcus pyogenes, a następnie czterem z nich penicylinę; pozostałe cztery myszy, którym nie wstrzyknięto penicyliny, trzymano jako kontrole. Wczesnym rankiem wszystkie myszy kontrolne były martwe, a wszystkie leczone - wciąż żyły. Chain nazwał wyniki "cudem". Naukowcy opublikowali swoje odkrycia w "The Lancet" w sierpniu 1940 r., opisując wytwarzanie, oczyszczanie i eksperymentalne stosowanie penicyliny, która ma wystarczającą siłę działania, aby chronić zwierzęta zakażone przez Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus i Clostridium septique. Zespół z Oksfordu opublikował następnie wyniki swoich badań klinicznych w 1941 r. W tym czasie firmy farmaceutyczne w Wielkiej Brytanii nie były w stanie produkować masowo penicyliny ze względu na zobowiązania w II wojnie światowej. Florey w tej sytuacji zwrócił się do rządu Stanów Zjednoczonych o pomoc finansową. Władze Northern Regional Research Laboratory (NRRL) w Peoria, Illinois, USA wyraziły chęć finansowania przedsięwzięcia. Florey i Heatley dotarli do Peoria w stanie Illinois, aby spotkać się z Charlesem Thomem, głównym mikologiem amerykańskiego Departamentu Rolnictwa i Andrew Jacksonem Moyerem, dyrektorem północnego laboratorium badawczego Departamentu. Thom także rozpoznał rzadkość szczepu Penicilium notatum, ponieważ miał jeszcze tylko jeden inny szczep w swojej kolekcji 1000 szczepów Penicillium, który wytwarzał penicylinę. Od połowy 1941 r. wznowiono prace badawcze dotyczące penicyliny także w kilku innych ośrodkach naukowych, począwszy od poszukiwania szczepów, w tym zmutowanych, poprzez prowadzenie fermentacji i ekstrakcji produktu aż po suszenie i pakowanie preparatu. Wydajność syntezy penicyliny wzrosła z 3 (grupa Oksfordzka) do 24 j./ml. Wynikami tych prac zainteresował się Departament Rolnictwa USA oraz National Research Council i cztery firmy - Merck, Squibb, Pfizer i Lererle, a potem kilka następnych. Niesamowite właściwości lecznicze penicyliny stały się faktem, a zapotrzebowanie na nią było ogromne, ale głównym celem było wyprodukowanie takiej ilości jednostek penicyliny, aby możliwe było pokrycie zapotrzebowania na okres działań armii amerykańskiej w Europie wiosną 1944 r. Dalsze poszukiwania szczepów wysoko produktywnych przyniosły oczekiwane wyniki. Badanie przesiewowe i rozwój techniki w tym techniki mutacji, okazały się kluczowym czynnikiem sukcesu. Z wielu źródeł, w tym próbek gleby z całego świata, zebranych przez armię amerykańską, wyizolowano wiele setek szczepów producentów penicyliny. Najlepszym producentem penicyliny (oznaczonym jako NRRL 1951) było Penicillium chrysogenum izolowane ze spleśniałego melona kantalupa z rynku owoców Peoria, który po ulepszeniach produkował do 100 j./ml hodowli. Kolejny szczep z Wisconsin produkował już 1500 j./ml. Heatley pozostał w Peorii przez 6 miesięcy, aby pracować nad metodami hodowli szczepów Penicillium w skali przemysłowej. Florey udał się na wschód, by zainteresować rząd USA i firmy farmaceutyczne produkcją penicyliny. Bezprecedensowa współpraca Stanów Zjednoczonych i Wielkiej Brytanii w zakresie produkcji penicyliny była niezwykle udana. W 1941 r. Stany Zjednoczone nie miały wystarczającej ilości penicyliny do leczenia jednego pacjenta. Pod koniec 1942 r. dostępna była wystarczająca ilość penicyliny do leczenia mniej niż 100 pacjentów. Jednak do września 1943 r. zapasy były wystarczające, by zaspokoić potrzeby sił zbrojnych aliantów. Wszystkie te eksperymenty prowadzono w hodowlach powierzchniowych (na podłożu zestalonym agarem). Znacznie lepsze wydajności penicyliny (około 140 000 razy) uzyskano w hodowlach płynnych (zanurzeniowych/głębinowych) z zastosowaniem namoku kukurydzianego, co sprawiło że wydajność penicyliny rosła wykładniczo, a głównym problemem była ekstrakcja i oczyszczanie penicyliny w układach ciecz-ciecz, a następnie liofilizacja i krystalizacja. Penicylina stała się własnością publiczną oraz wielkim biznesem.
Bardzo pozytywne skutki leczenia zakażeń bakteryjnych z zastosowaniem penicyliny doprowadziły do przyznania Flemingowi, Chainowi i Floreyowi Nagrody Nobla w dziedzinie medycyny i fizjologii w 1945 r. Penicylinę izolowano także z innych mikroorganizmów, co doprowadziło do powstania nowego terminu, antybiotyków. W latach 1940 i 1950 wyodrębniono streptomycynę, chloramfenikol, erytromycynę, wankomycynę i wiele innych.
Na tym etapie rozwijała się szeroko zakrojona mikrobiologiczna produkcja nie tylko tradycyjnych towarów, np. piwa, alkoholu, sera, ale także nowych produktów, w tym kwasu cytrynowego i farmaceutyków o szczególnie dużym znaczeniu społecznym i ekonomicznym. Znaczenie ekonomiczne wzrosło w szczególności dzięki sukcesowi produkcji penicyliny. Kolejne antybiotyki, takie jak streptomycyna, stały się ogólnodostępne, a także pojawiła się nowa klasa produktów o wysokiej wartości, głównie metabolitów wtórnych, np. steroidów uzyskanych metodą biotransformacji.
1.2.5. Era postantybiotykowa (lata 1960-1975)
W tym okresie pojawiły się inne ważne produkty fermentacji mikroorganizmów, o rosnącym znaczeniu rynkowym - aminokwasy (L-glutamina, L-lizyna), węglowodany i ich pochodne (hydrolizaty, izomery), witaminy, rozpuszczalniki i enzymy do nowych zastosowań. Nowa generacja biokatalizatorów, opierająca się na technikach immobilizacji enzymów, doprowadziła do przełomu w przetwórstwie żywności i związków farmaceutycznych. Produkcja na wielką skalę została uruchomiona, dzięki użyciu biokatalizatorów do hydrolizy penicyliny (do syntezy półsyntetycznych antybiotyków ?-laktamowych) i izomeryzacji glukozy.
Od połowy lat siedemdziesiątych, w związku z kryzysem naftowym oraz świadomością, że zasoby naturalne się kurczą, powstały w agendach rządowych krajów rozwiniętych (Niemcy, Wielka Brytania, Japonia, USA i inne) koncepcje innowacyjnego potencjału i wzrostu gospodarczego oraz większego znaczenia zasobów surowców odnawialnych w przyszłości. W 1974 r. niemiecka organizacja chemiczna Dechema opracowała entuzjastyczny raport dla Niemieckiego Ministerstwa Edukacji i Nauki (Bundesministerium für Bildung und Wissenschaft). Było to pierwsze systematyczne opracowanie finansowania strategii badawczo-rozwojowej, zachęcające do innowacji w przemyśle. Podobne strategie powstały także w Wielkiej Brytanii, Japonii i Francji. W prace badawczo-rozwojowe najbardziej zaangażowano mikrobiologię, biologię komórki, biochemię oraz - w ograniczonym zakresie - biologię molekularną, genetykę i inżynierię chemiczną. Pojawiły się także w tych latach podręczniki do mikrobiologii stosowanej (jeszcze nie w sensie biotechnologii), a także do inżynierii biochemicznej. Pierwsze encyklopedie i serie na temat biotechnologii pod redakcją Rehma and Reeda zostały wydane przez Wiley-VCH Verlag, a pod redakcją Flickingera i Drew'a przez John Wiley & Sons Inc.
Tak więc pojawiła się nowa dyscyplina naukowa - biotechnologia - integrująca badania gospodarki innowacyjnej. Pierwsze dyplomy magisterskie i inżynieryjne z zakresu inżynierii biochemicznej były przyznawane absolwentom University College London już w 1960 r., a kolejne w 1970 r. na Politechnice w Berlinie (Technical University of Berlin). Pojawiły się pierwsze czasopisma naukowe z tej dziedziny: "Journal of Microbiological & Biochemical Engineering" (1958), w następnych latach "Biotechnology & Bioengineering", "Applied Microbiology" zmieniony na "Environmental & Applied Microbiology" oraz "Applied Microbiology & Biotechnology".
1.2.6. Era nowej biotechnologii (po 1975 r.)
Po 1975 r. nastąpiła era technologii związanych z rekombinacjami DNA oraz pojawienie się pierwszych produktów marketowych (szczepionki, insulina). Wdrożenia aplikacyjne z zakresu biotechnologii przedstawiono w tabeli 1.1.
Pierwszym przełomem tej ery było ustanowienie modelu struktury molekularnej DNA przez Jima Watsona i Francisa Cricka na podstawie danych krystalograficznych Rosalindy Franklin, która w 1953 r. pracowała w laboratorium Morrisa Wilkinsa. Kolejne sukcesy - badania struktury molekularnej, złożonych struktur organicznych, w tym pierwszej struktury trójwymiarowej białka, mioglobiny, a następnie penicyliny, witaminy B12 i insuliny.
Znaczenie struktury molekularnej DNA jako materiału, z którego powstają geny, doceniło wielu naukowców z chemii i biologii, głównie mikrobiologii: Gregor Mendel, Friedrich Miescher, Phoebus Levene, William Astbury, Erwin Chargaff, Oswald Avery, Francois Jacob, Jacques Monod, Ole Maaloe, Max Delbrück, Sydney Brenner i inni.
Tabela 1.1. Wdrożenia aplikacyjne z zakresu biotechnologii
Rok wdrożenia
Rodzaj aplikacji
1971
Farley, Cape, Glaser: powołanie pierwszej spółki biotechnologicznej Cetus
1972
przemysłowa produkcja kwasu 6-aminopenicylinowego
1974
przemysłowa produkcja syropu glukozowo-fruktozowego
1976
Swanson, Boyer: fundacja drugiej spółki biotechnologicznej Genentec
1977
dalsze nowe firmy biotechnologiczne
1978
rekombinowana ludzka insulina (Genentec)
1980
prace nad rekombinowaną ?-amylazą (Novo)
1982
zatwierdzenie ludzkiej insuliny przez FDA (Eli Lilly)
1982
techniczna produkcja rekombinowanej ?-galaktozydazy (Bochringer Mannhein, Germany)
1984
zmechanizowane sekwencjonowanie DNA
1988
Leder, Steward: patent na produkcję transgenicznych myszy
1996
masowa hodowla zrekombinowanych nasion kukurydzy
1999
CELERA - przemysłowe sekwencjonowanie genomu
1999
mikrobiologiczna produkcja witaminy C
Źródło: na podstawie Buchholz K. i Collins J. 2013. The roots - a short history of industrial microbiology and biotechnology. Appl. Microbiol. Biotechnol., 97: 3747-3762, zmienione.
Opisanie przez Watsona i Cricka w 1953 r. struktury DNA spowodowało w następstwie istotny przełom naukowy oraz postęp w rozwoju licznych technik, które przyniosły sukcesy biotechnologii.
Berg, Cohen i Boyer w 1972 r. wprowadzili technologię rekombinowanego DNA (rDNA), konstruując pierwsze rekombinowane plazmidy i wirusy, które zostały wprowadzone odpowiednio do bakterii lub komórek zwierzęcych, gdzie autonomicznie się namnażały. Patent udzielony Cohenowi i Boyerowi oraz Uniwersytetowi Kalifornijskiemu został krytycznie skomentowany przez Berga.
W latach 80. i 90. XX w. wprowadzono techniki genetyczne w metodach pozyskiwania nowych szczepów przemysłowych. Nowe metody i narzędzia badawcze odegrały kluczową rolę w szybkiej ekspansji technologii rekombinacji. Obejmują one: techniki elektroforezy żelowej, wirowanie, trawienie DNA z zastosowaniem endonukleaz restrykcyjnych, sekwencjonowanie DNA, metody ekstrakcji genów, szereg metod klonowania mniejszych fragmentów DNA z wykorzystaniem plazmidów, kosmidów oraz fosmidów, klonowanie większych fragmentów DNA z zastosowaniem sztucznych chromosomów bakteryjnych BAC i drożdżowych YAC, metagenomika i ostatnio biologia syntetyczna. Projektowanie białek stało się racjonalnym narzędziem do produkcji biofarmaceutyków i rozwoju badań nad enzymami. Dzięki dostępności powyższych technik molekularnych klonowania genów u Gram-ujemnych pałeczek E. coli zaistniała dogodna sytuacja do łatwego opracowania wektorów do klonowania genów, które można przenieść do innych gatunków nie tylko bakterii. Dotyczy to identyfikacji plazmidów replikujących się w innych organizmach, które można eksprymować i wykorzystywać do selekcji w nowym gospodarzu, w tym w bakteriach, drożdżach, liniach komórek owadzich i komórkach roślinnych.
Połączenie technik inżynierii genetycznej i technologii rDNA umożliwiło szybkie komercyjne wykorzystanie wyników naukowych w świecie biznesu. Przełomem przemysłowym była rekombinowana ludzka insulina opracowana przez Genentech we współpracy z Ely Lilly w 1978 r. i zatwierdzona przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków w 1982 r. Warto podkreślić udział polskich badaczy i biotechnologów w dziele tworzenia insuliny ludzkiej (Gensulin). Prowadzone w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków w latach 1992-1995 badania nad opracowaniem technologii otrzymywania insuliny ludzkiej zaowocowały w 2000 r. uruchomieniem jej produkcji na skalę przemysłową. Polska stała się czwartym na świecie po USA, Danii i Niemczech producentem insuliny ludzkiej uzyskiwanej metodą inżynierii genetycznej. W ten sposób uzyskano możliwość nieograniczonej produkcji insuliny, bowiem do tej pory wszystkie preparaty insuliny były mniej lub bardziej oczyszczonymi preparatami insuliny wieprzowej lub wołowej. Kolejny przełomowy moment w historii badań nad insuliną nastąpił w 1996 r., w którym uzyskano analog insuliny ludzkiej - insulinę lispro - o niezwykle wartościowych cechach farmakodynamicznych, zmieniając jedynie kolejność dwóch końcowych aminokwasów (lizyny i proliny) w łańcuchu B.
Inne uzyskane produkty rekombinowane to głównie leki, których nie dało się wytworzyć innymi metodami, a które są bardzo interesujące z medycznego punktu widzenia: ludzki hormon wzrostu w 1983 r., ?-interferon i szczepionka przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B w 1986 r., tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) w 1987 r. i erytropoetyna w 1989 r. W ostatnich dekadach tą metodą produkuje się rekombinowane białka, w tym hormony i czynniki wzrostu, czynniki krzepnięcia krwi, cytokiny, przeciwciała monoklonalne i szczepionki jako najważniejsze biofarmaceutyki. Także produkcja antybiotyków stanowi ważny sektor biofarmaceutyków o wielu różnych właściwościach.
Transfer nauki do sfery gospodarczej zaowocował powstaniem nowych firm biotechnologicznych. Pierwszy powstał Cetus (1971 r.), następnie twórca "reakcji łańcuchowej polimerazy" PCR Kary'ego Mullisa, który wykreował diagnostykę genetyczną. W 1976 r. Herbert Boyer i Robert Swanson założyli firmę Genentech. Spośród innych ważniejszych założonych w tych latach firm można wymienić Biogen (1978 r.), Amgen (1980 r.) i Chiron (1981 r.).
W ciągu ostatnich 20 lat wdrożono nowe lub bardziej wydajne przemysłowe procesy związane z wykorzystaniem mikroorganizmów, dające czystsze, tańsze produkty lub substancje niedostępne przy użyciu klasycznych metod chemicznych. Ogólnie mówiąc, teraz można:
- przekształcać reakcje wtórne w główne szlaki metaboliczne; - optymalizować produkcję i wydajności procesów; - zmienić pierwotne szlaki metaboliczne, aby umożliwić stosowanie tańszych surowców lub uzyskanie wcześniej nieznanych cząsteczek; - wykorzystać właściwości enzymów w celu otrzymania nowych cząsteczek chiralnych.
Lista produktów uzyskanych tymi metodami zwiększa się co roku. W ich produkcję jest zaangażowanych wiele obszarów przemysłowych.
Do produktów najczęściej uzyskiwanych w mikrobiologii przemysłowej należą:
1) białka farmaceutyczne (ludzki interferon, naskórkowy czynnik wzrostu i hemoglobina, antygeny wirusowego zapalenia wątroby typu B, stabilizatory erytropoetyny i ludzkiej kosmówki, gonadotropina) otrzymywane z wykorzystaniem mikroorganizmów, takich jak Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha lub Agrobacterium tumefaciens; 2) rekombinowane enzymy do procesów przemysłowych z zastosowaniem mikroorganizmów; obejmują przemysłowy rynek enzymów stosowanych w produkcji żywności, detergentów, tekstyliów, przemysłu skórzanego, celulozowego i papierniczego; szczególnie interesujące są lipazy mikrobiologiczne, np. Lipolase? (wyprodukowany po raz pierwszy w 1994 r. przez duńską firmę Novozymes) jest pierwszym rekombinantem lipazy; została uzyskana przez klonowanie Thermomyces lanuginosus genu lipazy do genomu Aspergillus oryzae; 3) antybiotyki biosyntetyczne (w tym penicylina V) i naturalne (penicylina G); z 12 000 antybiotyków opisanych w 1995 r. ponad 20% może być wytwarzane przez grzyby nitkowate (biosyntetyczna i półsyntetyczna penicylina i cefalosporyna); 4) czynniki immunosupresyjne, w tym cyklosporyna A z Tolypocladium nivenum oraz mykofenolan mofetylu z kilku gatunków Penicillium; 5) czynniki hipocholesterolemiczne, w tym lowastatyna z Aspergillus terreus i prawastatyna z Penicillium citrium; 6) czynniki przeciwnowotworowe, takie jak taksol po raz pierwszy wykryty w roślinie, ale później produkowany przez Taxomyces andreanae; 7) mikotoksyny, w tym inhibitory adrenaliny, estrogeny i środki anaboliczne stosowane u bydła i owiec lub gibereliny w branżach piwowarskich i słodowniczych; 8) pigmenty, w tym astaksantyna karotenoidowa z Phaffia rhodozyma i ?-karotenoid z Blakeslea trispora, stosowane w przemyśle spożywczym i tekstylnym; 9) wielokrotnie nienasycone kwasy tłuszczowe, w tym kwas ?-linolowy z Mucor circinelloides i kwas arachidowy z Mortierella isabellina.
Równolegle rozwijała się produkcja klasycznych wyrobów, innych niż farmaceutyki, zarówno tradycyjnymi metodami mikrobiologicznymi, jak i rekombinacyjnymi. Najważniejsze produkty masowe to etanol, aminokwasy i kwasy organiczne, witaminy oraz biopolimery. Inżynieria metaboliczna została z powodzeniem zastosowana do optymalizacji wydajności, np. w produkcji aminokwasów. Natomiast wytwarzanie na bardzo dużą skalę etanolu, tradycyjnie produkowanego z surowców takich jak skrobia i cukier, jako dodatku do benzyny, wywołało ostrą krytykę ze względu na wykorzystywanie do tego upraw rolnych. Ostatnio pojawił się pomysł wykorzystywania biomasy celulozowej jako źródła biopaliw. Kolejne tematy to produkcja biogazu i energii elektrycznej wytwarzanej przez mikrobiologiczne ogniwa paliwowe. Metody rekombinacji DNA również znacząco wpłynęły na technologię enzymów od późnych lat siedemdziesiątych. Nadmierna ekspresja w szybko rosnących organizmach gospodarza o wysokiej produktywności białek umożliwiła tańszą produkcję na skalę przemysłową wielu enzymów, które wcześniej nie były łatwo dostępne, a są stosowane obecnie do produkcji żywności, detergentów oraz farmaceutyków.
Udało się także pozyskać rośliny transgeniczne celem zwiększenia plonów, dzięki nabytym cechom odporności na choroby i herbicydy. Transgeniczne rośliny są uprawiane na bardzo dużą skalę w USA, Argentynie, Brazylii, Kanadzie, a także w innych krajach.
Wielkim osiągnięciem w 2000 r. było zsekwencjonowanie ludzkiego genomu dzięki międzynarodowej współpracy i całkowitym wydatkom rzędu 3 mld dolarów. Zadanie to zostało zrealizowane przez duże międzynarodowe konsorcjum i w dużej mierze niezależnie od grupy Craiga Ventera. Wyniki sekwencjonowania Human Genome Project mogą umożliwić odkrycie i wyprodukowanie setek nowych farmaceutyków, z których wiele to naturalne ludzkie produkty genowe wcześniej niedostępne w znaczących ilościach, lub preparatów wolnych od wirusów, znacznie poprawiających diagnostykę i rewolucjonizujących medycynę.
Wreszcie obiecujące badania i eksperymenty z komórkami macierzystymi, śledzenie różnicowania się komórek i embriogenezy, otwierające nową dziedzinę badań medycznych, produkcję modeli chorób genetycznych, nowe podejście do rozumienia raka. Na przykład niemiecka biolog Christiane Nüsslein--Volhard otrzymała wraz z Erikiem Wieschausem i Edwardem B. Lewisem w 1995 r. Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny za badania nad genetyczną kontrolą rozwoju zarodka z wykorzystaniem muszki owocowej (Drosophila melanogaster).
Kolejnym wielkim wydarzeniem była chemiczna synteza całego genomu Mycoplasma genitalium przez Craiga Ventera, a następnie przeniesienie tego DNA do innego gatunku Mycoplasma, co spowodowało zastąpienie rezydującego genomu genomem całkowicie syntetycznym i utworzenie nowego szczepu zdolnego do ciągłej autoreplikacji (First Self-Replicating, Synthetic Bacterial Cell Constructed by J. Craig Venter Institute Researchers). Osiągnięcie to można uważać za dalszy krok w dziedzinie zapoczątkowanej przez Pasteura wykorzystującego żywe organizmy do tworzenia nowych komórek o nowym potencjale syntetycznym.
Bardzo duże pole do zastosowania biotechnologii stanowi technologia środowiskowa, która stała się ważnym przemysłem. Obejmuje ona oczyszczanie ścieków, zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych, stosowane w wielu małych i bardzo dużych instalacjach.
1.3. Główne procesy w mikrobiologii przemysłowej
1.3.1. Upstream processes
W uprzednich latach liczne i różne produkty pozyskiwano z naturalnych źródeł lub syntetyzowano w procesach chemicznych - niektóre w procesach fermentacji prowadzonych przez mikroorganizmy, inne zaś - w procesach konwersji biologicznej. Zalety wykorzystania mikroorganizmów w tego typu procesach są takie, że dodatkowo uzyskuje się w nich biomasę, mają szybkie tempo wzrostu oraz można stosować stosunkowo tanie substraty, w wielu przypadkach odpady z różnych gałęzi bioprzemysłu. Generalnie produkty mikrobiologii przemysłowej i biotechnologii mikroorganizmów są wykorzystywane w procesach opisywanych jako upstream, procesach fermentacji oraz procesach downstream.
Do procesów poprzedzających należą izolacja i selekcja mikroorganizmów, szczepów przydatnych do taniej produkcji dużych ilości oczekiwanego produktu, przechowywanie szczepów przemysłowych, namnażanie szczepionki (inoculum), selekcja substratu, optymalizacja i produkcja podłoża hodowlanego oraz przemysłowa sterylizacja podłoża produkcyjnego. Mikroorganizmy jako czynniki produkujące oraz surowy materiał jako substrat fermentacyjny są najistotniejsze w upstream processes. Szczepy stosowane w produkcji są istotne we wszystkich fermentacjach przemysłowych, ponieważ wzrost efektywności produkcji redukuje koszty produkcji. W wielu przypadkach szczepy przemysłowe są poddawane mutagenezie lub rekombinacji DNA - przechodzą procesy via mutacje i rekombinacje. Dobór podłoża zależy od skali fermentacji. W skali laboratoryjnej do sporządzania podłoża często stosuje się substraty czyste chemicznie. Stosowanie ich na skalę przemysłową jest nieopłacalne z powodu wysokich kosztów. Dlatego stosuje się tanie substraty, często odpadowe z różnych gałęzi bioprzemysłu, tj. roślinne lub zwierzęce odpady przemysłowe, które mają różny i zmienny skład. Są one także sprawdzane pod kątem przydatności w skali laboratoryjnej.
1.3.2. Procesy fermentacji
Z przemysłowego punktu widzenia fermentacja to wytwarzanie produktu przez biomasę mikroorganizmu w warunkach tlenowych lub beztlenowych. Fermentację zwykle prowadzi się w fermentorach lub bioreaktorach, które są optymalne do produkcji biomasy oraz syntezy produktu fermentacji. Przyrost biomasy oraz synteza produktu zależą od wielu czynników, takich jak temperatura, pH, zawartość tlenu, mieszania hodowli i poziom piany oraz właściwości szczepu przemysłowego. W zależności od potrzeb stosuje się proste bioreaktory lub fermentory wyposażone w różne systemy kontroli procesu fermentacji podłączone do komputera. Fermentację przemysłową można prowadzić w hodowlach stacjonarnych, hodowlach półciągłych lub z ciągłym przepływem - w zależności od typu końcowego produktu.
1.3.3. Downstream processes
Downstream processes to wszystkie czynności wykonywane po zakończeniu procesu fermentacji, głównie związane z odzyskaniem produktu fermentacji, jego oczyszczaniem i krystalizacją oraz konfekcjonowaniem. Należą do nich również procesy związane z wydzieleniem biomasy i jej rozbiciem w celu pozyskania dodatkowych ilości produktu oraz usunięcie biomasy z płynu fermentacyjnego. W celu oddzielenia biomasy mieszaninę hodowlaną filtruje się lub odwirowuje, a biomasę rozbija chemicznie, fizycznie lub biologicznie - w zależności od trwałości produktu fermentacji. Ponieważ uzyskiwane ilości produktu są zwykle niewielkie, prowadzi się proces jego zagęszczania. Do oczyszczania produktu można stosować różne metody, jak np. chromatografię, dializę, odwróconą osmozę, destylację lub ekstrakcję rozpuszczalnikami - w zależności od typu i poziomu czystości finalnego produktu. Wodę lub rozpuszczalnik usuwa się przez odparowywanie lub suszenie produktu albo jego krystalizację. Generalnie są to procesy: oddzielenia i rozbijania komórek biomasy celem wyekstrahowania wewnątrzkomórkowego metabolitu, zagęszczanie, oczyszczanie, jakościowa i ilościowa kontrola produktu, pakowanie i przechowywanie produktu, sterylizacja oraz oczyszczanie ścieków powstałych w czasie produkcji i odzyskiwania produktu.
1.3.4. Skale hodowli mikroorganizmów
Słownik Cambridge definiuje zwiększanie skali produkcji mikrobiologicznej jako zwiększanie wielkości bioreaktora (fermentora), objętości hodowli i syntezy produktu (zwiększenie produkcji w jednostce czasu trwania fermentacji). W procesie hodowli mikroorganizmów w bioreaktorach zachodzi synteza produktu, w następnym etapie jego odzyskiwanie i oczyszczanie oraz usuwanie powiązanych z produkcją odpadów. Typowanie szczepów produkcyjnych jest zwykle testowane w laboratorium w fermentorach objętości 0,5-10 l (skala laboratoryjna), co musi zostać przełożone na produkcję w skali przemysłowej (pełna skalę produkcji) w bioreaktorach objętości 20 000-2 000 000 l. Jeżeli w procesie występuje wiele nowych czynników, skalowanie dużych procesów przemysłowych najlepiej wykonać w dwóch etapach. Pierwszym etapem jest skala pilotażowa w fermentorach objętości 100-10 000 l z dopasowanym odpowiednio sprzętem. Celem skali pilotażowej jest przeniesienie skali laboratoryjnej na proces w realistycznie zmniejszonej wersji produkcji przemysłowej. W większości przypadków nie jest on w pełni zintegrowany i wymaga pewnych korekt. Na tym etapie sprawdza się wszystkie możliwe parametry kinetyczne fermentacji, poddaje korekcie oraz szacuje poniesione koszty. Drugi etap to skala demonstracyjna (skala demo) z fermentorami wielkości 10 000-100 000 l, która służy minimalizacji ryzyka kapitałowego podejmowanego do realizacji w pełnowymiarowej skali produkcyjnej (walidacja procesu). Jeśli stopień nowości jest stosunkowo niski, skala demonstracyjna może być pominięta.
1.3.5. Skala produkcji przemysłowej zależna od parametrów fermentacji
Na proces fermentacji wpływają następujące czynniki:
1) stopień czystości dodawanych składników podłoża fermentacyjnego (naturalne lub o wysokiej czystości, zmienność między seriami surowców); może nastąpić nagromadzenie inhibitorów i niesfermentowanych składników podłoża, które mają wpływ nie tylko na przebieg fermentacji, ale także na bilans wodny i dynamikę przebiegu procesu, zwłaszcza w fermentacjach prowadzonych w hodowlach półciągłych; 2) degradacja surowców oraz tworzenie inhibitorów mających wpływ na dynamikę fermentacji, procesy downstream oraz oczyszczanie ścieków i utylizację odpadównastępujące podczas sterylizacji podłoża fermentacyjnego lub dodawanego surowca zależnie od temperatury oraz czasu trwania sterylizacji; 3) czas mieszania w procesie fermentacji wzrasta wraz z gradientami pewnych parametrów kontrolujących proces fermentacji i może być zależny od temperatury, wartości pH oraz stężenia substancji odżywczych, które mogą mieć negatywny wpływ na proces fermentacji; 4) współczynnik przenikalności gazu (kLa) przez ciecz i biomasę mający negatywny wpływ na wydajność fermentacji; 5) podwyższenie ciśnienia cząstkowego gazów pO2 i pCO2 wraz ze zwiększeniem brutto ciśnienia hydrostatycznego podłoża hodowlanego, które wpływa na wydajność procesu fermentacji; 6) większe naprężenia ścinające (siły ścinające) w zależności od skali mogą spowodować uszkodzenie komórek, wpływając na proces fermentacji i/lub wydajność procesów downstream; 7) wydłużony czas przetrzymywania podłoża w trakcie fermentacji oraz czas odzyskiwania produktu może wpływać na skład chemiczny podłoża, lizę komórek szczepów produkcyjnych oraz procesy downstream i utylizację odpadów i ścieków; 8) dezaktywacja hodowli zależna od temperatury oraz czasu zatrzymania podłoża w procesie fermentacji także wpływa na lizę komórek, skład podłoża, co ma wpływ na procesy downstream i oczyszczanie ścieków.
Powiedzenie: 'the early bird may get the worm, but the second mouse gets the cheese' "najszybszy ptak dostaje robaka, a druga mysz dostaje ser" mówi, że należy uczyć się od innych, którzy byli wcześniej. Niektórzy z najmądrzejszych, jakich znamy, to najszybsze ptaki. Są genialni i szybcy, przekonani, że mogą zrobić wszystko sami znacznie szybciej, taniej i lepiej niż ktokolwiek inny, chociaż nigdy tego wcześniej nie robili. Nie doceniają wyzwań związanych z powiększaniem skali, a czasem nawet je ignorują. Nadrabiają to potem, zmuszając się nierozważnie do pójścia na skróty i dokonywania skoków w dobrej wierze. Zamiast ich naśladować, lepiej być "drugą myszą" - zgromadzić wokół siebie wykwalifikowane zespoły inżynierów (aby ocenili nowe możliwości), pozyskać wskazówki co do bieżących prac badawczo-rozwojowych, aby określić realistyczne oczekiwania i z powodzeniem skalować proces bez niespodzianek.
1.4. Bioaktywne związki pozyskiwane z organizmów
Produkty naturalne w najszerszym znaczeniu to związki chemiczne izolowane z różnych żywych organizmów. Podstawowe metabolity (polisacharydy, proteiny, kwasy nukleinowe i kwasy tłuszczowe) są powszechne we wszystkich systemach biologicznych. Metabolity wtórne, nazywane także metabolitami wyspecjalizowanymi, to małocząsteczkowe (MW ~3000), niezwykle różnorodne chemicznie, często pełniące niejasne funkcje, charakterystyczne głównie dla pewnych organizmów. Aktywność biologiczna lub bioaktywność metabolitów może pojawiać się na poziomie molekularnym in vitro lub in vivo. Definicja metabolitów obejmuje wszystkie metabolity, które regulują procesy wzrostu, replikacje i/lub wykazują pewien rodzaj reakcji (regulujących, hamujących, stymulujących) na komórki na poziomie biochemicznym, w minimalnym stężeniu. Wyróżnia się dwa rodzaje związków bioaktywnych: nieantybiotykowe związki bioaktywne (metabolity "inne bioaktywne") oraz antybiotyki. Metabolity wyizolowane z mikroorganizmów wykazujące działanie antybakteryjne, antygrzybiczne, antypierwotniacze, antynowotworowe i/lub antywirusowe to antybiotyki. Wszystkie inne metabolity bioaktywne można nazwać naturalnymi bioregulatorami lub modulatorami biochemicznymi. Bez wątpienia "klasyczne" antybiotyki stanowią tylko część (być może mniejszą) możliwych bioaktywnych metabolitów mikroorganizmów. Praktyczne znaczenie antybiotyków i innych metabolitów jest ogromne. Są szeroko stosowane w leczeniu ludzi i zwierząt, a także w rolnictwie i badaniach naukowych. Produkty naturalne, w tym metabolity drobnoustrojów, można praktycznie wykorzystać na trzy różne sposoby:
1) bezpośrednio w medycynie, w rolnictwie lub w jakichkolwiek innych dziedzinach; 2) jako materiał wyjściowy do późniejszej modyfikacji chemicznych lub mikrobiologicznych; 3) jako związki wiodące do syntezy chemicznej nowych analogów lub jako szablony projektowanych leków.
W tabeli 1.2 przedstawiono przybliżone liczby aktywnych metabolitów produkowanych przez Bacteria i Eukarya.
Tabela 1.2. Liczebności metabolitów produkowanych przez organizmy żywe
Źródło
Wszystkie znane związki
Inne bioaktywne
Antybiotyki
Produkty naturalne
> 1 000 000
200 000-250 000
25 000-30 000
Królestwo roślin
ogółem
550 000-650 000
128 000-177 000
~ 13 000
glony i porosty
3000-5000
1500-2000
~ 1000
rośliny wyższe
500 000-600 000
~ 100 000
10 000-12 000
Bakterie
> 50 000
22 000-23 000
~ 17 000
Królestwo zwierząt
ogółem
300 000-400 000
50 000-100 000
~ 5000
pierwotniaki
kilkaset tysięcy
100-200
~ 50
zwierzęta morskie
20 000-25 000
7000-8000
3000-4000
owady/robaki itp.
8000-10 000
800-1000
150-200
kręgowce
200 000-250 000
50 000-70 000
~ 1000
Źródło: na podstawie Bérdy J. 2005. Bioactive microbial metabolites, J. Antibiot 58: 1-26, zmienione.
Związki bioaktywne są produkowane przez rośliny, takie jak glony, porosty, wątrobowce, paprocie i mchy, rośliny naczyniowe o działaniu antydrobnoustrojowym/antywirusowym. Często występujące metabolity roślinne (alkaloidy, flawonoidy, terpenoidy itp.) wykazują również różne działania toksyczne i farmakologiczne, a także niektóre działania antybakteryjne i antynowotworowe/antywirusowe. W najszerszym znaczeniu wszystkie powyższe związki można również uznać za antybiotyki. W królestwie zwierząt producentami metabolitów są Porifera, Mollusca, Cnidaria, Anthozoa, Echinodermata oraz Bryozoa. W grupie produktów morskich, w tym wodorostów morskich związki inne bioaktywne nieantybiotyczne stanowią około połowę wszystkich obecnie znanych bioaktywnych produktów morskich.
Z praktycznego punktu widzenia większość obecnie znanych biologicznych aktywności związków nieantybiotycznych można sklasyfikować jako:
- środki farmakologiczno-biochemiczne lub medyczne, - środki wykorzystywane w rolnictwie, - środki regulacyjne, biofizyczne i inne.
Pierwszy rodzaj związków innych bioaktywnych o możliwej aktywności medycznej w największej liczbie obejmuje potencjalnie bardzo ważne metabolity hamujące działanie enzymów. Obecnie ponad 3000 związków, o których wiadomo, wykazuje aktywność hamującą wobec około 300 do 350 różnych układów enzymatycznych. Istnieje około 800 związków immunoaktywnych (immunosupresyjnych, immunostymulujących) oraz setki związków o najróżniejszych regulacjach: hamujących, agonistycznych i antagonistycznych, w tym przeciwzapalnych/przeciwutleniających, hipocholesterolemicznych, antymetabolitowych, a także o różnym działaniu toksycznym (mikotoksycznych). W tej grupie występują także związki o działaniu biochemicznym, takim jak hamowanie zestawu tubuliny (mikrotubuli), związki indukujące interferon, antymitotyczne/antymitogenne, uszkadzające DNA, działające antymutagennie, wykazujące aktywności indukujące apoptozę, hamujące angiogenezę. Testy wykrywające te aktywności wykazują bardzo duże różnice, a zakres ostatecznych efektów fizjologicznych, biologicznych, biochemicznych, fitochemicznych i mikrobiologicznych obejmuje blisko tysiąc kategorii bioaktywności. Związki odkryte za pomocą tych specyficznych metod można nazwać (odróżniając je od antybiotyków) mikrobiologicznymi produktami leczniczymi lub biofarmaceutykami. Warto tu wspomnieć o cyklosporynie, lowastatynie lub takrolimusie, mających duże znaczenie praktyczne.
Większość dopuszczalnych środowiskowo związków rolnych to produkty naturalne lub powstające w wyniku modyfikacji produktów naturalnych. Związki aktywne w rolnictwie mogą również zawierać związki hamujące enzymy. Tak zwane działania rolnicze obejmują głównie pestycydy (insektycydy, środki roztoczobójcze, larwicydy, repelenty, środki odstraszające, środki przeciwdziałające plewom, środki antypasożytnicze, przeciw robakom, cystycydy, akarycydy, nematocydy, związki przeciwwymiotne, algicydy i inne środki zwalczania biologicznego) oraz herbicydy (substancje fitoaktywne: fitotoksyny, regulatory wzrostu roślin, inhibitory kiełkowania, allelozwiązki, fitohormony, induktory chlorozy). Dodatki paszowe, środki konserwujące, permytanty/promotory wzrostu są stosowane w hodowli i weterynarii. Awermektyna, monensyna i bialafos są najbardziej użytecznymi związkami drobnoustrojowymi w tej grupie.
Istnieje też grupa związków wytwarzanych przez mikroorganizmy. Są to specyficzne inhibitory metaboliczne, czynniki wzrostu, czynniki morfogenne i sporogenne, związki sygnałowe, induktory powstawania grzybni, stymulatory produkcji, autoregulatory, feromony bakteryjne, induktory różnicowania; siderofory są włączone do tej grupy. Związki te odgrywają istotną rolę w cyklu życia drobnoustrojów i mogą być stosowane w testach biologicznych lub jako odczynniki biochemiczne. Związki o właściwościach biofizycznych to biosurfaktanty, bioflokulanty, czynniki chelatujące i jonowe, zmiatacze minerałów, jonofory, związki fotoaktywne, radioprotektanty i inne.
Antybiotyki i inne produkty naturalne będące metabolitami mogą być produkowane przez organizmy prokariotyczne (bakterie) oraz eukariotyczne (rośliny i zwierzęta). Zdolność wytwarzania metabolitów przez organizmy jest jednak bardzo nierównomierna. Wśród bakterii i roślin pewne grupy, jak Actinobacteria (promieniowce) i Mycota (grzyby), są najczęstszymi i najbardziej wszechstronnymi producentami. W grupie bakterii różne metabolity są produkowane przez gatunki Bacillus, Pseudomonas oraz Myxobacteria i Cyanobacteria. Wśród bakterii dominują gatunki należące do rodzaju Streptomyces. które wytwarzają około połowę wszystkich metabolitów. Liczebności naturalnych związków bioaktywnych przedstawiono w tabeli 1.3. Wśród grzybów dominują grzyby strzępkowe oraz pewne grupy grzybów wyższych (Ascomycota i Basidiomycota).
Tabela 1.3. Prawdopodobne liczebności odkrytych antybiotyków produkowanych przez mikroorganizmy w latach 1940-2010
Okres
Lata
1940-1974
Lata
1975-2000
Lata
2001-2010
Ogółem
Bakterie
ogółem
7635
17 130
5760
30 525
Myxobacteria
25
400
210
635
Cyanobacteria
10
30
1250
1290
Actinobacteria
3900
9300
3800
17 000
Streptomyces spp.
2900
5100
2400
10 400
pozostałe bakterie
800
2300
1100
4200
Grzyby
ogółem
1270
7400
6560
15 230
grzyby strzępkowe
950
5400
4900
11 250
Basidiomycota
300
1800
1500
3600
inne grzyby
20
200
160
380
Źródło: na podstawie Bérdy J. 2012. Thoughts and facts about antibiotics: Where we are now and where we are heading. J. Antibiot. 65: 441, zmienione.
Promieniowce są producentami wielu antybiotyków. Wytwarzają związki antybakteryjne należące do ?-laktamów, aminoglikozydów, tetracyklin, makrolidów, glikopeptydów, lipopeptydów, streptogramidów i innych. Pod względem budowy chemicznej związki wytwarzane przez promieniowce należą m.in. do poliketydów, peptydów, butenolidów, chinonów, makrolidów, alkaloidów, laktonów, laktamów, terpenów i terpenoidów.
Od kilku lat obiektem badań są peptydy o działaniu przeciwbakteryjnym. Szczególne nadzieje wiąże się z bakteriocynami - peptydami antydrobnoustrojowymi syntetyzowanymi przez bakterie mlekowe, głównie z rodzaju Lactobacillus. Są one wykorzystywane w przemyśle spożywczym jako naturalne konserwanty. Oczyszczone preparaty bakteriocyn, takie jak: dostępne komercyjnie nizyna A czy pediocyna PA-1, z powodzeniem są stosowane do konserwowania żywności. Bakteriocyny są oporne na wysoką temperaturę i tolerują szerszy zakres pH w porównaniu do klasycznych antybiotyków. Bakteriocyny są zwykle syntetyzowane rybosomalnie, w czasie fazy G1 i nie są metabolitami wtórnymi, dzięki czemu są coraz częstszym przedmiotem zainteresowania bioinżynierii. Masa cząsteczkowa bakteriocyn rzadko przekracza 10 kDa, ulegają trawieniu przez proteazy w przewodzie pokarmowym człowieka, dzięki czemu są bezpieczne jako konserwanty żywności.
Istnieje ogromna populacja prostych pochodnych aminokwasów, cyklicznych dipeptydów (CDP) występujących w wielu żywych organizmach: mikroorganizmach, roślinach i zwierzętach. Wytwarzane są dwoma głównymi szlakami: jako produkty syntetaz NRP lub, co ciekawsze, w unikalnym procesie enzymatycznym wykorzystującym syntazy cyklopeptydowe (CDPS), które wykorzystują aminoacylo-tRNA jako substrat. Analiza genomów wskazuje na obecność genów CDPS w więcej niż 50 różnych bakteriach, także grzybach i pierwotniakach. Są to najstarsze peptydy, mogące zawierać niebiałkowe aminokwasy. Stanowią rdzenień strukturalny wielu złożonych produktów naturalnych (diketopiperazyn), które obejmują aranotyny, bicyklomycynę, chetocynę, cyklomarazyny, gliotoksyny i wertycylinę. Niektóre bakterie wytwarzają nawet sześć odmian CDP. Sugeruje się, że wiele CDP wzmacnia funkcje bakteryjne, takie jak wzrost, różnicowanie i sygnalizację komórkową, niektóre zaś odgrywają niewyjaśnioną rolę. Stwierdzono, że CDP w warunkach laboratoryjnych są antynowotworowe, antywirusowe, antybakteryjne, antygrzybicze, immunosupresyjne, neurologiczne, jako cząsteczki sygnałowe, endokrynologiczne lub mogą być czynnikami wirulencji.
Literatura rekomendowana
Buchholz K. i Collins J. 2013. The roots - a short history of industrial microbiology and biotechnology, Appl. Microbiol. Biotechnol., 97:3747-3762.
Demain A.L., Vandamme E.J., Collins J., Buchholtz K. 2017. History of Industrial Biotechnology, [w:] Industrial Biotechnology: Microorganisms, red. Wittmann C., Liao J.C., Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.
Demain A.L. 2000. Microbial biotechnology. Trends Biotechnol, 18: 26-31.
Sanchez S. i Demain A. 2009. Microbial Primary Metabolites: Biosynthesis and Perspectives, [w:] Encyclopedia of Industrial Biotechnology: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology, 10.1002/9780470054581.eib167.
Thirumurugan D., Cholarajan A., Raja S.S.S., Vijayakumar R. 2016. An Introductory Chapter: Secondary Metabolites, http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.79766 [dostęp: 7.10.2019].
