Rozdział 1 Elżbieta Nowacka Fizjologia hemostazy

1.1. Wstęp

Hemostaza to zespół złożonych i zintegrowanych procesów utrzymujących integralność zamkniętego układu krążenia po przerwaniu ciągłości łożyska naczyniowego. Celem jest wytworzenie skrzepu w miejscu uszkodzenia, ale jednocześnie jego rozpuszczenie i przywrócenie prawidłowej perfuzji. W hemostazie udział biorą następujące elementy: ściana naczyń krwionośnych, płytki krwi, układ krzepnięcia i układ fibrynolizy. Podział na etapy: hemostaza naczyniowa, płytkowa, osoczowa; hemostaza pierwotna, wtórna; krzepnięcie i fibrynoliza jest obecnie umowny i daleko uproszczony, ale umożliwia zobrazowanie i ułatwia opis zachodzących zjawisk.

1.2. Rola ściany naczyniowej w procesie hemostazy

Podstawowa forma reakcji ściany naczyniowej na uszkodzenie uwarunkowana jest jej budową. Ściany wszystkich naczyń o większej średnicy niż naczynia włosowate zbudowane są z trzech warstw: zewnętrznej, środkowej i endotelium (śródbłonka).

Warstwa zewnętrzna zwana przydanką, utworzona głównie z włókien kolagenu, odpowiada za przytwierdzenie naczynia do otoczenia. Media, czyli warstwa środkowa zbudowana jest z okrężnej mięśniówki gładkiej oraz - w zależności od typu naczynia (tętnica, żyła) - różnej liczby włókien kolagenowych i sprężystych. Uszkodzenie większych naczyń to przede wszystkim w pierwszym okresie reakcja mięśniówki i skurcz naczynia ograniczający wypływ krwi oraz bezpośrednie przyleganie płytek do odsłoniętego kolagenu. W obrębie naczyń włosowatych, w których działają siły o dużym module ścinania, a zbudowanych tylko z endotelium i otaczającej blaszki podstawnej z perycytami o właściwościach kurczliwych, nie obserwujemy klasycznego skurczu naczynia i nie dochodzi po jego uszkodzeniu do odsłaniania kolagenu. Za przyleganie płytek krwi do miejsca uszkodzenia odpowiedzialny jest syntetyzowany bezpośrednio w komórkach endotelium czynnik von Willebranda (von Willebrand factor - vWF).

Wyróżniamy trzy typy naczyń włosowatych: o ścianie ciągłej, okienkowej i zatokowe o ścianie nieciągłej. Pierwsze to najpowszechniejszy typ, o selektywnej przepuszczalności kontrolowanej przez ciągłą warstwę komórek śródbłonka. Naczynia o ścianie okienkowej, w których komórki śródbłonka mają bardzo niewielkie otworki (fenestracje), występują w narządach, gdzie wymiana między tkankami a krwią jest szczególnie intensywna (kosmki jelitowe, nerka, gruczoły dokrewne). Włośniczki okienkowe charakteryzuje duża przepuszczalność dla substancji wysokocząsteczkowych. Naczynia włosowate zatokowe o ścianie nieciągłej mają większą średnicę, charakteryzują się albo dużymi otworami w komórkach śródbłonka, albo szerokimi szczelinami pomiędzy tymi komórkami. Blaszka podstawna może być nieciągła lub nieobecna. Naczynia te pozwalają na swobodne przechodzenie przez ich ścianę wszystkich substancji, a także komórek; występują w wątrobie, śledzionie i szpiku krwiotwórczym.

Niezależnie od średnicy i typu histologicznego naczyń, endotelium - najbardziej wewnętrzny element ściany naczyniowej - zbudowany jest z pojedynczej warstwy komórek. Prawidłowy śródbłonek, o zachowanej ciągłości cechuje się ujemnym ładunkiem elektrycznym, a jego komórki odpychają do wnętrza naczynia ujemnie naładowane elementy komórkowe, w tym płytki krwi. Endotelium z uwagi na funkcje parai autokrynne odgrywa kluczową rolę w procesie odpowiedzi hemostatycznej każdego naczynia. Elementem wazomotorycznej odpowiedzi jest wydzielany przez komórki śródbłonka tlenek azotu (NO). Uwalniany z komórek, w odpowiedzi na siły ścinające, działające na ścianę naczynia, które powstają w procesie przepływu krwi, powoduje wazodylatację, ale jednocześnie ogranicza adhezję i agregację płytek.

Endotelina powstająca ze swojego prekursora (pre-pro-endoteliny), wpływając na swoisty receptor ETA, działa przeciwstawnie. Strategicznym elementem odpowiedzi śródbłonka naczyniowego, zwłaszcza w obrębie naczyń włosowatych, w procesie hemostazy jest wspomniany vWF, gromadzony w obrębie komórki w ciałkach Weibela-Palade'a, a wydzielany po jej stymulacji przez mediatory krzepnięcia, do których zaliczamy trombinę i plazminę oraz mediatory zapalenia, tj.: leukotrieny, histaminę, endotoksyny, czynnik martwicy nowotworu (tumor necrosis factor - TNF) oraz interleukiny. Trombomodulina - swoista glikoproteina przezbłonowa - jest integralną częścią endotelium. Składa się z ok. 550 aminokwasów podzielonych na pięć domen. Trzy należą do tzw. domen zewnątrzkomórkowych. Czwarta to część przezbłonowa, a piąta stanowi ogon zakotwiczony w obrębie cytoplazmy komórkowej. Jej odsłonięcie w wyniku uszkodzenia powoduje odłączenie zewnętrznego fragmentu (tzw. frakcja rozpuszczalna TM; ang. soluble thrombomodulin - sTM), co umożliwia jego przyłączenie do krążącej trombiny i wytworzenie kompleksu trombina-trombomodulina (T-TM) zmieniającego właściwości trombiny z prozakrzepowej na przeciwzakrzepową. Kompleks T-TM odpowiedzialny jest, z jednej strony, za hamowanie tworzenia fibryny i aktywacji płytek, a z drugiej - za aktywację krążącego białka C (patrz: naturalne inhibitory układu krzepnięcia).

1.3. Płytki krwi

Płytki krwi odgrywają podstawową rolę we współczesnym komórkowym modelu fizjologicznej odpowiedzi ustroju na uszkodzenie naczynia. Tworzą pierwotny czop hemostatyczny i jednocześnie uczestniczą w reakcjach krzepnięcia i fibrynolizy. Należą do elementów komórkowych procesu hemostazy i powstają w szpiku kostnym oraz płucach poprzez fragmentację cytoplazmy megakariocytów. Płytki należą do najmniejszych elementów komórkowych krwi i są bezjądrowymi fragmentami cytoplazmy megakariocytów szpiku kostnego.

Liczba płytek we krwi obwodowej wynosi 150-450 × 109/l. Żyją przeciętnie w krążeniu 10 dni, a "stare" usuwane są przez swoiste grupy komórek należących do układu siateczkowo-śródbłonkowego głównie śledziony i wątroby. Krążące płytki w warunkach spoczynkowych mają owalny kształt, są naładowane ujemnie i nie wykazują właściwości trombogennych. Około 2/3 puli trombocytów krąży we krwi, a 1/3 jest zmagazynowana w śledzionie i stanowi tzw. pulę wymienialną.

Błona komórkowa płytki krwi ma budowę trójwarstwową; wpukla się, tworząc system licznych kanalików, którymi odbywa się transport substancji zawartych w ziarnistościach. Cytoszkietet płytki utworzony przez podbłonowy układ mikrowłókienek i mikrokanalików warunkuje utrzymanie jej dyskoidalnego kształtu w stanie spoczynku oraz odpowiada za zmianę kształtu i tworzenie wypustek (pseudopodia - nibynóżek) po aktywacji.

W obrębie cytoplazmy płytek znajdują się: ziarnistości gęste, ziarnistości ?, lizosomy i mitochondria. Ziarnistości gęste zawierają czynniki proagregacyjne: nukleotydy adeninowe (ADP, ATP), guaninowe (GDP, GTP), aminy (serotoninę, histaminę), fosfoinozytole oraz jony dwuwartościowe (wapń, magnez). Skład ziarnistości ? pełniących funkcję czynników adhezyjnych i naprawczych jest bardziej złożony. Uwalniane są z nich swoiste białka jak czynnik płytkowy 4 (PF4), ?-tromboglobulina (?TG) oraz glikoproteiny bogate w serynę. Ziarnistości ? zawierają białka adhezyjne, do których zaliczamy: fibronektynę, vWF, trombospondynę i witronektynę. Białka uczestniczące w procesie krzepnięcia (fibrynogen; czynnik V, VII, XI, XII, XIII, kininogen), naturalne inhibitory trombiny (białko S) oraz w procesie fibrynolizy (plazminogen, inhibitor ?-plazminy i tkankowy aktywator plaz-minogenu tPA).

Płytki krwi wydzielają zawarte w lizosomach kwaśne hydrolazy, katepsyny, karboksypeptydazy, kolagenazy, fosfatazy kwaśne i glikohydrolazy. Ponadto mogą uwalniać katecholaminy i albuminy. Na powierzchni płytek obecne są białka adhezyjne odpowiedzialne za proces adhezji i agregacji płytek. Kompleks glikoprotein GIb-IX-V, obecny zawsze na powierzchni płytek, jest szczególnie istotny dla ich adhezji do czynnika von Willebranda związanego z podśródbłonkową tkanką łączną. Wynikiem adhezji jest aktywacja płytek.

Zaktywowane płytki zmieniają swoją strukturę przestrzenną - wysuwają pseudopodia i tym samym wielokrotnie zwiększają własną powierzchnię czynną. Jednocześnie w procesie aktywacji dochodzi do uwolnienia zawartości ziarnistości płytkowych i prowadzi ona do udostępnienia fosfolipidów błonowych, głównie fosfatydyloseryny, oraz umożliwia aktywację osoczowych czynników krzepnięcia. Ekspresja czynnika GP IIa-IIIb po aktywacji odpowiada za agregację płytek przy udziale fibrynogenu. Tworzenie mostków fibrynogenowych w procesie agregacji warunkuje tworzenie się konglomeratów płytkowych. Powstała na zaktywowanych płytkach trombina przekształca fibrynogen w fibrynę, która oplata powstałe konglomeraty.

1.4. Układ krzepnięcia

Krzepnięcie to uwarunkowany wieloczynnikowo proces. Polega on na zmianie krążącego w osoczu rozpuszczalnego fibrynogenu w nierozpuszczalną fibrynę w wyniku aktywacji kolejnych czynników krzepnięcia. Udział w nim biorą wspomniane wyżej elementy komórkowe, czyli płytki krwi oraz czynniki osoczowe.

Do osoczowych czynników krzepnięcia zaliczamy:

czynnik I - fibrynogen;

czynnik II - protrombinę;

czynnik III - tromboplastynę tkankową;

czynnik IV - zjonizowany wapń (Ca2+);

czynnik V - proakcelerynę (czynnik chwiejny, ac-globulinę);

czynnik VI - akcelerynę (aktywny czynnik V);

czynnik VII - prokonwertynę (czynnik stabilny);

czynnik VIII - globulinę przeciwkrwawiączkową (czynnik przeciwhemofilowy A, AHG);

czynnik IX - zwany czynnikiem Christmasa (czynnik przeciwhemofilowy B, PTC);

czynnik X - czynnik Stuarta-Prowera;

czynnik XI - PTA (czynnik przeciwhemofilowy C, czynnik Rosenthala);

czynnik XII - czynnik Hagemana (czynnik kontaktowy);

czynnik XIII - stabilizujący włóknik (fibrynaza, FSF - czynnik Laki-Loranda, transglutamidaza osoczowa);

prekalikreinę - czynnik Fletchera;

kininogen - czynnik Fitzgeralda (zob. tab. 1.1).

Tabela 1.1. Charakterystyka czynników krzepnięcia

CZYNNIK

MASA CZĄSTECZKOWA (kDA)

STĘŻENIE W OSOCZU

(?g/ml)

CZAS PÓŁTRWANIA

(godziny)

Fibrynogen

340

3000

90

Protrombina

72

100

60

Czynnik tkankowy

45

-

-

Czynnik V

330

10

12-36

Czynnik VII

50

0,5

6

Czynnik VIII

330

0,1

12

Czynnik IX

56

5

24

Czynnik X

56

10

40

Czynnik XI

125

5

60

Czynnik XII

76

30

50

Czynnik XIII

320

60

168-336

(7-14 dni)

Prekalikreina

85

50

48

Wielkocząsteczkowy kininogen

120

70

144

(6 dni)

Kolejność numeracji czynników krzepnięcia oznaczonych cyframi rzymskimi jest przypadkowa i niezależna od żadnego poglądu teoretycznego.

Z wyjątkiem czynnika III (tromboplastyny tkankowej) i jonów wapnia wszystkie pozostałe, biorące udział w procesie krzepnięcia, są białkami osocza. Osoczowe czynniki krzepnięcia dzielimy na trzy grupy: czynniki zespołu protrombiny zależne od witaminy K (II, VII, IX i X), wrażliwe na trombinę (I, V, VIII, XI, XIII) i czynniki kontaktu (XI i XII, prekalikreina, kininogen wielkocząsteczkowy). Większość czynników występuje w osoczu w postaci proenzymów (zymogenów), a ich przekształcanie do form aktywnych enzymów (proteaz serynowych) odbywa się drogą wieloenzymatycznej proteolizy, czyli hydrolitycznego rozkładu wiązania peptydowego. Każdy proenzym jest substratem dla uprzednio zaktywowanego enzymu, a każdy enzym - produktem tej reakcji. Czynniki V i VIII oraz wielkocząsteczkowy kininogen nie wykazują aktywności enzymatycznej i pełnią funkcję kofaktorów (katalizatorów). Opisane wyżej jony wapnia, także należące do kofaktorów układu tworzenia skrzepu, występują na wielu poziomach aktywacji czynników krzepnięcia. Niezbędne są do aktywacji II, VII, IX i X czynnika krzepnięcia oraz warunkują prawidłową polimeryzację fibryny (zamiana fibryny labilnej w stabilną) za pomocą aktywnego czynnika XIII.

Fibrynogen - należy do czynników krzepnięcia występujących w najwyższym stężeniu w osoczu. Jest asymetryczną wielkocząsteczkową glikoproteiną o budowie dimerowej. Obie podjednostki składają się z łańcuchów polipeptydowych aminokwasów, a monomery połączone są wiązaniami dwusiarczkowymi. Synteza fibrynogenu zachodzi w hepatocytach, a za jej prawidłowy przebieg odpowiedzialne są trzy geny ulokowane na chromosomie 4. Fibrynogen jest trzygrudkową strukturą przestrzenną składającą się z dwóch domen D i jednej domeny E. Liczne wiązania dwusiarczkowe międzyi śródłańcuchowe utrzymują jego strukturę. Fibrynogen wiąże jony wapnia, które odgrywają kluczową rolę w utrzymywaniu struktury przestrzennej, podatności na denaturację oraz ograniczeniu trawienia fibrynogenu przez plazminę. Prawie cały znajduje się w osoczu, mimo że należy do białek uwalnianych z ziarnistości płytek pod wpływem czynników aktywujących. Jego stężenie jest wielokrotnie wyższe niż innych osoczowych czynników krzepnięcia i wynosi średnio 1,5-3,5 g/l, przy okresie półtrwania ok. 4 dni, a dobowy obrót oscyluje pomiędzy 1,7 a 5 g.

Fibrynogen należy do białek uwalnianych z płytek krwi. Organizm ludzki nie ma jego depozytów. Białko to bierze udział w regulacji lepkości krwi i należy do białek ostrej fazy. Synteza przez hepatocyty i fibroblasty może wzrosnąć w odpowiedzi na interleukinę 6, interleukinę 1 oraz jako efekt aktywacji układu krzepnięcia i fibrynolizy.